Whole-exome sequencing (WES) has been widely used for analysis of human genetic diseases, but its value for the pharmacogenomic profiling of individuals is not well studied. Initially, we performed an in-depth evaluation of the accuracy of WES variant calling in the pharmacogenes CYP2D6 and CYP2C19 by comparison with MiSeq® amplicon sequencing data (n = 36). This analysis revealed that the concordance rate between WES and MiSeq® was high, achieving 99.60% for variants that were called without exceeding the truth-sensitivity threshold (99%), defined during variant quality score recalibration. Beyond this threshold, the proportion of discordant calls increased markedly. Subsequently, we expanded our findings beyond CYP2D6 and CYP2C19 to include more genes genotyped by the iPLEX® ADME PGx Panel in the subset of twelve samples. WES performed well, agreeing with the genotyping panel in approximately 99% of the selected pass-filter variant calls. Overall, our results have demonstrated WES to be a promising approach for pharmacogenomic profiling, with an estimated error rate of lower than 1%. Quality filters, particularly variant quality score recalibration, are important for reducing the number of false variants. Future studies may benefit from examining the role of WES in the clinical setting for guiding drug therapy.

Abstract Complex biological traits and disease often involve patterns of gene expression that can be characterised and examined. Here we present ICARUS v2.0, an update to our single cell RNA-seq analysis web server with additional tools to investigate gene networks and understand core patterns of gene regulation in relation to biological traits. ICARUS v2.0 enables gene co-expression analysis with MEGENA, transcription factor regulated network identification with SCENIC, trajectory analysis with Monocle3, and characterisation of cell-cell communication with CellChat. Cell cluster gene expression profiles may be examined against Genome Wide Association Studies with MAGMA to find significant associations with GWAS traits. Additionally, differentially expressed genes may be compared against the Drug-Gene Interaction database (DGIdb 4.0) to facilitate drug discovery. ICARUS v2.0 offers a comprehensive toolbox of the latest single cell RNA-seq analysis methodologies packed into an efficient, user friendly, tutorial style web server application (accessible at https://launch.icarus-scrnaseq.cloud.edu.au/ ) that enables single cell RNA-seq analysis tailored to the user’s dataset.

Abstract The isolation of intact single cells from frozen tissue is a challenge due to the mechanical and physical stress inflicted upon the cell during the freeze-thaw process. Ruptured cells release ambient RNA into the cell suspension, which can become encapsulated into droplets during droplet based single cell RNA-seq library preparation methods. The presence of ambient RNA in droplets has been suggested to impact data quality, however there have been limited reports on single cell RNA-seq data from frozen tissue. Here, we compare the results of single cell RNA-seq derived from disaggregated cells from frozen brain tissue with single nuclei RNA-seq derived from purified nuclei of identical tissue using the 10X Genomics Chromium 3’gene expression assay. Our results indicated that presence of ambient RNA in the cell suspension resulted in single cell RNA-seq data with a 25-fold lower gene count, a 5-fold lower UMI count per cell and a 2-fold lower fraction of reads per cell compared with single nuclei RNA-seq data. Cell clustering with the single cell RNA-seq data was unable to resolve the heterogeneity of brain cell types. Our conclusion is that nuclei from frozen tissue are the superior substrate for single cell transcriptome analysis.

Abstract Objective Rapid, cost-effective identification of genetic variants in small candiate genomic regions remains a challenge, particularly for less well equipped or lower throughput laboratories. Application of Oxford Nanopore Technologies’ MinION sequencer has the potential to fulfil this requirement. We have developed a multiplexing assay which pools PCR amplicons for MinION sequencing to enable sequencing of multiple templates from multiple individuals which could be applied to gene-targeted diagnostics. Methods A combined strategy of barcoding and sample pooling was developed for simultaneous multiplex MinION sequencing of 100 PCR amplicons, spanning 30 loci in DNA isolated from 82 neurodevelopmental cases and family members. The target regions were chosen for further interegation because a potentially disease-causative variants had been identified in affected individuals by Illumina exome sequencing. The pooled MinION sequences were deconvoluted by aligning to custom references using the guppy aligner software. Results Our multiplexing approach produced interpretable and expected sequence from 29 of the 30 targeted genetic loci. The sequence variant which was not correctly resolved in the MinION sequence was adjacent to a five nucleotide homopolymer. It is already known that homopolymers present a resolution problem with the MinION approach. Interstingly despite equimolar quantities of PCR amplicon pooled for sequencing, significant variation in the depth of coverage (139x – 21,499x; mean = 9,050, std err = 538.21) was observed. We observed independent relationships between depth of coverage and target length, and depth of coverage and GC content. These relationships demonstrate biases of the MinION sequencer for longer templates and those with lower GC content. Conclusion We demonstrate an efficient approach for variant discovery or confirmation from short DNA templates using the MinION sequencing device. With less than 140x depth of coverage required for accurate genotyping, the methodology described here allows for rapid highly multiplexed targeted sequencing of large numbers of samples in a minimally equipped laboratory.

The pathophysiology of stress cardiomyopathy (SCM), also known as takotsubo syndrome, is poorly understood. SCM usually occurs sporadically, often in association with a stressful event, but clusters of cases are reported after major natural disasters. There is some evidence that this is a familial condition. We have examined three possible models for an underlying genetic predisposition to SCM. Our primary study cohort consists of 28 women who suffered SCM as a result of two devastating earthquakes that struck the city of Christchurch, New Zealand, in 2010 and 2011. To seek possible underlying genetic factors we carried out exome analysis, Cardio-MetaboChip genotyping array analysis and array comparative genomic hybridization on these subjects. The most striking finding from these analyses was the observation of a markedly elevated rate of rare, heterogeneous copy number variants (CNV) of uncertain clinical significance (in 12/28 subjects). Several of these CNVs clearly impacted on genes of cardiac relevance including RBFOX1, GPC5, KCNRG, CHODL, and GPBP1L1. There is no physical overlap between the CNVs, and the genes they impact do not fall into a clear pathophysiological pathway. However, the recognition that SCM cases display a high rate of unusual CNV, and that SCM predisposition may therefore be associated with these CNVs, offers a novel perspective and a new approach by which to understand this enigmatic condition.

Vaccine challenge responses are an integral component in the diagnostic evaluation of patients with primary antibody deficiency, including Common Variable Immunodeficiency Disorders (CVID). There are no studies of vaccine challenge responses in primary hypogammaglobulinemia patients not accepted for subcutaneous/intravenous immunoglobulin (SCIG/IVIG) replacement compared to those accepted for such treatment. Vaccine challenge responses in patients enrolled in two long-term prospective cohorts, the New Zealand Hypogammaglobulinemia Study (NZHS) and the New Zealand CVID study (NZCS), were compared in this analysis. Almost all patients in the more severely affected SCIG/IVIG treatment group achieved protective antibody levels to tetanus toxoid and H. influenzae type B (HIB). Although there was a highly significant statistical difference in vaccine responses to HIB, tetanus and diphtheria toxoids, there was substantial overlap in both groups. In contrast, there was no significant difference in Pneumococcal Polysaccharide antibody responses to Pneumovax® (PPV23). This analysis illustrates the limitations of evaluating vaccine challenge responses in patients with primary hypogammaglobulinemia to establish the diagnosis of CVID and in making decisions to treat with SCIG/IVIG. The conclusion from this study is that patients with symptoms attributable to primary hypogammaglobulinemia with reduced IgG should not be denied SCIG/IVIG if they have normal vaccine responses.

Background: The popularisation and decreased cost of genome resequencing has resulted in an increased use in molecular diagnostics. While there are a number of established and high quality bioinfomatic tools for identifying small genetic variants including single nucleotide variants and indels, currently there is no established standard for the detection of copy number variants (CNVs) from sequence data. The requirement for CNV detection from high throughput sequencing has resulted in the development of a large number of software packages. These tools typically utilise the sequence data characteristics: read depth, split reads, read pairs, and assembly-based techniques. However the additional source of information from read balance, defined as relative proportion of reads of each allele at each position, has been underutilised in the existing applications. Results: We present Read Balance Validator (RBV), a bioinformatic tool which uses read balance for prioritisation and validation of putative CNVs. The software simultaneously interrogates nominated regions for the presence of deletions or multiplications, and can differentiate larger CNVs from diploid regions. Additionally, the utility of RBV to test for inheritance of CNVs is demonstrated in this report. Conclusions: RBV is a CNV validation and prioritisation bioinformatic tool for both genome and exome sequencing available as a python package from https://github.com/whitneywhitford/RBV

Abstract In recent years, improvements in throughput of single cell RNA-seq have resulted in a significant increase in the number of cells profiled. The generation of single cell RNA-seq datasets comprising >1 million cells is becoming increasingly common, giving rise to demands for more efficient computational workflows. Here, we present an update to our single cell RNA-seq analysis web server application, ICARUS (available at https://launch.icarus-scrnaseq.cloud.edu.au/ ) that allows effective analysis of large-scale single cell RNA-seq datasets. ICARUS v3 utilises the geometric cell sketching method to subsample cells from the overall dataset for dimensionality reduction and clustering that can be then projected to the large dataset. We then extend this functionality to select a representative subset of cells for downstream data analysis applications including differential expression analysis, gene co-expression network construction, gene regulatory network construction, trajectory analysis, cell-cell communication inference and cell cluster associations to GWAS traits. We demonstrate analysis of single cell RNA-seq datasets using ICARUS v3 of 1.3 million cells completed within the hour.

Background: Whole genome sequencing (WGS) has increased in popularity and decreased in cost over the past decade, rendering this approach as a viable and sensitive method for variant detection. In addition to its utility for single nucleotide variant detection, WGS data has the potential to detect Copy Number Variants (CNV) to fine resolution. Many CNV detection software packages have been developed exploiting four main types of data: read pair, split read, read depth, and assembly based methods. The aim of this study was to evaluate the efficiency of each of these main approaches in detecting deletions. Methods: WGS data and high confidence deletion calls for the individual NA12878 from the Genome in a Bottle consortium were the benchmark dataset. The performance of Breakdancer, CNVnator, Delly, FermiKit, and Pindel was assessed by comparing the accuracy and sensitivity of each software package in detecting deletions exceeding 1kb. Results: There was considerable variability in the outputs of the different WGS CNV detection programs. The best performance was seen from Breakdancer and Delly, with 92.6% and 96.7% sensitivity, respectively and 34.5% and 68.5% false discovery rate (FDR), respectively. In comparison, Pindel, CNVnator, and FermiKit were less effective with sensitivities of 69.1%, 66.0%, and 15.8%, respectively and FDR of 91.3%, 69.0%, and 31.7%, respectively. Concordance across software packages was poor, with only 27 of the total 612 benchmark deletions identified by all five methodologies. Conclusions: The WGS based CNV detection tools evaluated show disparate performance in identifying deletions ≥1kb, particularly those utilising different input data characteristics. Software that exploits read pair based data had the highest sensitivity, namely Breakdancer and Delly. Breakdancer also had the second lowest false discovery rate. Therefore, in this analysis read pair methods (Breakdancer in particular) were the best performing approaches for the identification of deletions ≥1kb, balancing accuracy and sensitivity. There is potential for improvement in the detection algorithms, particularly for reducing FDR. This analysis has validated the utility of WGS based CNV detection software to reliably identify deletions, and these findings will be of use when choosing appropriate software for deletion detection, in both research and diagnostic medicine.

Abstract Background Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative genetic disorder caused by an expansion in the CAG repeat tract of the huntingtin ( HTT ) gene resulting in a triad of behavioural, cognitive, and motor defects. Current knowledge of disease pathogenesis remains incomplete, and no disease course-modifying interventions are in clinical use. We have previously reported the development and characterisation of the OVT73 transgenic sheep model of HD. OVT73 captures an early prodromal phase of the disease with an absence of motor symptomatology even at 5-years of age and no detectable striatal cell loss. Methods To better understand the disease-initiating events we have undertaken a single nuclei transcriptome study of the striatum of an extensively studied cohort of 5-year-old OVT73 HD sheep and age matched wild-type controls. Results We have identified transcriptional upregulation of genes encoding N-methyl-D-aspartate (NMDA), α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and kainate receptors in OVT73 medium spiny neurons, the cell type preferentially lost early in HD. This observation supports the glutamate excitotoxicity hypothesis as an early neurodegeneration cascade-initiating process. Moreover, we also observed the downstream consequences of excitotoxic stress, including a downregulation of transcription of components for the oxidative phosphorylation complexes. We also found that pathways whose activity has been proposed to reduce excitotoxicity, including the CREB family of transcription factors ( CREB1 , ATF2, ATF4 and ATF7 ) were transcriptionally downregulated. Conclusions To our knowledge, the OVT73 model is the first large mammalian HD model that exhibits transcriptomic signatures of an excitotoxic process in the absence of neuronal loss. Our results suggest that glutamate excitotoxicity is a disease-initiating process. Addressing this biochemical defect early may prevent neuronal loss and avoid the more complex secondary consequences precipitated by cell death.