Abstract Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has shown enormous potential in revealing molecular structures, dynamics and couplings in complex systems. However, the sensitivity of SRS is fundamentally limited to milli-molar level due to the shot noise and the small modulation depth. To overcome this barrier, we revisit SRS from the perspective of energy deposition. The SRS process pumps molecules to their vibrationally excited states. The thereafter relaxation heats up the surrounding and induces refractive index changes. By probing the refractive index changes with a laser beam, we introduce stimulated Raman photothermal (SRP) microscopy, where a >500-fold boost of modulation depth is achieved. Versatile applications of SRP microscopy on viral particles, cells, and tissues are demonstrated. SRP microscopy opens a new way to perform vibrational spectroscopic imaging with ultrahigh sensitivity. One-Sentence Summary We demonstrate a new spectroscopic imaging method that improves the signal intensity by >500-fold.

Current vibrational imaging methods either have limited penetration depth or poor spatial resolution. We developed a shortwave infrared photothermal (SWIP) microscope for deep-tissue chemical imaging with sub-micron resolution and demonstrated SWIP imaging with biological tissues.

Abstract Real-time tracking of intracellular carbohydrates remains challenging. While click chemistry allows bio-orthogonal tagging with fluorescent probes, the reaction permanently alters the target molecule and only allows a single snapshot. Here, we demonstrate click-free mid-infrared photothermal (MIP) imaging of azide-tagged carbohydrates in live cells. Leveraging the micromolar detection sensitivity for 6-azido-trehalose (TreAz) and the 300-nm spatial resolution of MIP imaging, the trehalose recycling pathway in single mycobacteria, from cytoplasmic uptake to membrane localization, is directly visualized. A peak shift of azide in MIP spectrum further uncovers interactions between TreAz and intracellular protein. MIP mapping of unreacted azide after click reaction reveals click chemistry heterogeneity within a bacterium. Broader applications of azido photothermal probes to visualize the initial steps of the Leloir pathway in yeasts and the newly synthesized glycans in mammalian cells are demonstrated.

By optically sensing the mid-infrared absorption induced photothermal effect, midinfrared photothermal (MIP) microscope enables super-resolution IR imaging and scrutinizing of biological systems in an aqueous environment. However, the speed of current lock-in based sample-scanning MIP system is limited to 1.0 millisecond or longer per pixel, which is insufficient for capturing dynamics inside living systems. Here, we report a single pulse laserscanning MIP microscope that dramatically increases the imaging speed by three orders of magnitude. We harness a lock-in free demodulation scheme which uses high-speed digitization to resolve single IR pulse induced contrast at nanosecond time scale. To realize single pulse photothermal detection at each pixel, we employ two sets of galvo mirrors for synchronized scanning of mid-infrared and probe beams to achieve an imaging line rate over 2 kHz. With video-rate imaging capability, we observed two types of distinct dynamics of lipids in living cells. Furthermore, by hyperspectral imaging, we chemically dissected a single cell wall at nanometer scale. Finally, with a uniform field of view over 200 by 200 μm 2 and 2 Hz frame rate, we mapped fat storage in free-moving C. elegans and live embryos.

Acquiring complete infrared and Raman vibrational information is designed for precise chemical analysis. We report a comprehensive vibrational photothermal (VIP) microscope that detects IR and Raman active modes with a single shot.

Abstract While protein aggregation is a hallmark of many neurodegenerative diseases, acquiring structural information on protein aggregates inside live cells remains challenging. Traditional microscopy does not provide structural information on protein systems. Routinely used fluorescent protein tags, such as Green Fluorescent Protein (GFP), might perturb native structures. Here, we report a counter‐propagating mid‐infrared photothermal imaging approach enabling mapping of secondary structure of protein aggregates in live cells modeling Huntington's disease. By comparing mid‐infrared photothermal spectra of label‐free and GFP‐tagged huntingtin inclusions, we demonstrate that GFP fusions indeed perturb the secondary structure of aggregates. By implementing spectra with small spatial step for dissecting spectral features within sub‐micrometer distances, we reveal that huntingtin inclusions partition into a β‐sheet‐rich core and a ɑ‐helix‐rich shell. We further demonstrate that this structural partition exists only in cells with the [ RNQ + ] prion state, while [ rnq − ] cells only carry smaller β‐rich non‐toxic aggregates. Collectively, our methodology has the potential to unveil detailed structural information on protein assemblies in live cells, enabling high‐throughput structural screenings of macromolecular assemblies.

Abstract While protein aggregation is a hallmark of many neurodegenerative diseases, acquiring structural information on protein aggregates inside live cells remains challenging. Traditional microscopy does not provide structural information on protein systems. Routinely used fluorescent protein tags, such as Green Fluorescent Protein (GFP), might perturb native structures. Here, we report a counter‐propagating mid‐infrared photothermal imaging approach enabling mapping of secondary structure of protein aggregates in live cells modeling Huntington's disease. By comparing mid‐infrared photothermal spectra of label‐free and GFP‐tagged huntingtin inclusions, we demonstrate that GFP fusions indeed perturb the secondary structure of aggregates. By implementing spectra with small spatial step for dissecting spectral features within sub‐micrometer distances, we reveal that huntingtin inclusions partition into a β‐sheet‐rich core and a ɑ‐helix‐rich shell. We further demonstrate that this structural partition exists only in cells with the [ RNQ + ] prion state, while [ rnq − ] cells only carry smaller β‐rich non‐toxic aggregates. Collectively, our methodology has the potential to unveil detailed structural information on protein assemblies in live cells, enabling high‐throughput structural screenings of macromolecular assemblies.

Protein aggregation, in the form of amyloid fibrils, is intimately correlated with many neurodegenerative diseases. Despite recent advances in structural biology, it remains challenging to acquire structural information of proteins in live cells. Tagging with fluorescent proteins, like green fluorescent protein (GFP), is routinely used for protein visualization. Yet, this method alone cannot provide detailed structural information on the protein system of interest, and tagging proteins has the potential to perturb native structure and function. Here, by fluorescence-detected as well as label-free scattering-based mid-infrared photothermal (MIP) microscopy, we demonstrate nanoscale mapping of secondary structure of protein aggregates in a yeast model of Huntington9s disease. We first used GFP as a highly sensitive photothermal reporter to validate β-sheet enrichment in huntingtin (htt) protein aggregates. We then obtained label-free structural maps of protein aggregates. Our data showed that the fluorescent protein tag indeed perturbed the secondary structure of the aggregate, evident by a spectral shift. Live cell MIP spectroscopy further revealed the fine spatial distribution of structurally distinct components in protein aggregates, featuring a 246-nm diameter core highly enriched in β-sheet surrounded by a α-helix-rich shell. Interestingly, this structural partition exists only in presence of the [RNQ+] prion, a prion that acts to facilitate the formation of other amyloid prions. Indeed, when htt is induced to aggregate in the absence of this prion ([rnq-] state), it forms non-toxic amyloid aggregates exclusively. These results showcase the potential of MIP for unveiling detailed and subtle structural information on protein systems in live cells.