Abstract P2X receptors are ATP-activated cation channels involved in a variety of physiological functions. Among the seven subtypes of P2X receptors, the P2X4 subtype plays important roles in both the immune system and the central nervous system, particularly in neuropathic pain. Therefore, P2X4 receptors are of increasing interest as potential drug targets, and several P2X4 subtype-specific inhibitors have been developed. However, the mechanism of allosteric inhibition of P2X4 receptors remains largely unclear due to the lack of structural information. Here, we report the cryo-EM structures of the zebrafish P2X4 receptor in complex with two P2X4 subtype-specific antagonists, BX430 and BAY-1797. Both antagonists bind to the same allosteric site located at the subunit interface at the top of the extracellular domain. Structure-based mutational analysis by electrophysiology identified the important residues for the allosteric inhibition of both zebrafish and human P2X4 receptors. Interestingly, in the previously reported apo structure, the binding pocket is closed and too narrow to accommodate allosteric modulators. Structural comparison revealed the ligand-dependent structural rearrangement of the binding pocket to stabilize the binding of allosteric modulators, which in turn would prevent the structural changes of the extracellular domain associated with channel activation. Furthermore, comparison with the previously reported P2X structures of other subtypes provided mechanistic insights into subtype-specific allosteric inhibition. Overall, the present work provides structural insights into the allosteric inhibition mechanism of P2X4 receptors, facilitating the design and optimization of specific modulators for P2X4 receptors.

P2X receptors are extracellular ATP-gated ion channels that form homo- or heterotrimers and consist of seven subtypes. They are expressed in various tissues, including neuronal and nonneuronal cells, and play critical roles in physiological processes such as neurotransmission, inflammation, pain, and cancer. As a result, P2X receptors have attracted considerable interest as drug targets, and various competitive inhibitors have been developed. However, although several P2X receptor structures from different subtypes have been reported, the limited structural information of P2X receptors in complex with competitive antagonists hampers the understanding of orthosteric inhibition, hindering the further design and optimization of those antagonists for drug discovery. Here, we determined the cryo-EM structures of the mammalian P2X7 receptor in complex with two classical competitive antagonists of pyridoxal-59-phosphate derivatives, PPNDS and PPADS, at 3.3 and 3.6 angstrom resolution, respectively, and performed structure-based mutational analysis by patch-clamp recording as well as MD simulations. Our structures revealed the orthosteric site for PPADS/PPNDS, and structural comparison with the previously reported apo- and ATP-bound structures showed how PPADS/PPNDS binding inhibits the conformational changes associated with channel activation. In addition, structure-based mutational analysis identified key residues involved in the PPNDS sensitivity of P2X1 and P2X3, which are known to have higher affinity for PPADS/PPNDS than other P2X subtypes. Overall, our work provides structural insights into the orthosteric inhibition and subtype specificity of P2X receptors by the classical P2X antagonists, pyridoxal-59-phosphate derivatives, thereby facilitating the rational design of novel competitive antagonists for P2X receptors.

Abstract MgtE is a Mg 2+ -selective ion channel whose orthologs are widely distributed from prokaryotes to eukaryotes, including humans, and play an important role in the maintenance of cellular Mg 2+ homeostasis. Previous functional analyses showed that MgtE transports divalent cations with high selectivity for Mg 2+ over Ca 2+ . Whereas the high-resolution structure determination of the MgtE transmembrane (TM) domain in complex with Mg 2+ ions revealed a Mg 2+ recognition mechanism of MgtE, the previous Ca 2+ -bound structure of the MgtE TM domain was determined only at moderate resolution (3.2 Å resolution), which was insufficient to visualize the water molecules coordinated to Ca 2+ ions. Thus, the structural basis of the ion selectivity of MgtE for Mg 2+ over Ca 2+ has remained unclear. Here, we showed that the metal-binding site of the MgtE TM domain binds to Mg 2+ ∼500-fold more strongly than Ca 2+ . We then determined the crystal structure of the MgtE TM domain in complex with Ca 2+ ions at a higher resolution (2.5 Å resolution), allowing us to reveal hexahydrated Ca 2+ , which is similarly observed in the previously determined Mg 2+ -bound structure but with extended metal-oxygen bond lengths. Our structural, biochemical, and computational analyses provide mechanistic insights into the ion selectivity of MgtE for Mg 2+ over Ca 2+ .