ABSTRACT Following the Zika virus (ZIKV) outbreak in the Americas, ZIKV was causally associated with microcephaly and a range of neurological and developmental symptoms, termed congenital Zika syndrome (CZS). The isolates responsible for this outbreak belonged to the Asian lineage of ZIKV. However, in-vitro and in-vivo studies assessing the pathogenesis of African-lineage ZIKV demonstrated that African-lineage isolates often replicated to high titer and caused more severe pathology than Asian-lineage isolates. To date, the pathogenesis of African-lineage ZIKV in a translational model, particularly during pregnancy, has not been rigorously characterized. Here we infected four pregnant rhesus macaques with a low-passage strain of African-lineage ZIKV and compared its pathogenesis to a cohort of four pregnant rhesus macaques infected with an Asian-lineage isolate and a cohort of mock-infected controls. Viral replication kinetics were not significantly different between the two experimental groups and both groups developed robust neutralizing antibody titers above levels considered to be protective. There was no evidence of significant fetal head growth restriction or gross fetal harm at delivery in either group. However, a significantly higher burden of ZIKV vRNA was found in maternal-fetal interface tissues in the macaques exposed to an African-lineage isolate. Our findings suggest that ZIKV isolates of any genetic lineage pose a threat to women and their infants. IMPORTANCE ZIKV was first identified over 70 years ago in Africa, but most of our knowledge of ZIKV is based on studies of the distinct Asian genetic lineage, which caused the outbreak in the Americas in 2015-16. In its most recent update, the WHO stated that improved understanding of African-lineage pathogenesis during pregnancy must be a priority. Recent detection of African-lineage isolates in Brazil underscores the need to understand the impact of these viruses. Here we provide the first comprehensive assessment of African-lineage ZIKV infection during pregnancy in a translational non-human primate model. We show African-lineage isolates replicate with similar kinetics to Asian-lineage isolates and are capable of infecting the placenta. However, there was no evidence of more severe outcomes with African-lineage isolates. Our results highlight both the threat that African-lineage ZIKV poses to women and their infants and the need for future epidemiological and translational in-vivo studies with African-lineage ZIKV.

Countermeasures against Zika virus (ZIKV), including vaccines, are frequently tested in nonhuman primates (NHP). Macaque models are important for understanding how ZIKV infections impact human pregnancy due to similarities in placental development. The lack of consistent adverse pregnancy outcomes in ZIKV-affected pregnancies poses a challenge in macaque studies where group sizes are often small (4-8 animals). Studies in small animal models suggest that African-lineage Zika viruses can cause more frequent and severe fetal outcomes. No adverse outcomes were observed in macaques inoculated with a low dose of African-lineage ZIKV at gestational day (GD) 45. Here, we inoculate eight pregnant rhesus macaques with a higher dose of African-lineage ZIKV at GD 45 to test the hypothesis that adverse pregnancy outcomes are dose-dependent. Three of eight pregnancies ended prematurely with fetal death. ZIKV was detected in both fetal and placental tissues from all cases of early fetal loss. Further refinements of this challenge system (e.g., varying the dose and timing of infection) could lead to an even more consistent, unambiguous fetal loss phenotype for assessing ZIKV countermeasures in pregnancy. These data demonstrate that high-dose inoculation with African-lineage ZIKV causes pregnancy loss in macaques and also suggest that ZIKV-induced first trimester pregnancy could be strain-specific.

Abstract Zika virus (ZIKV) can be transmitted vertically from mother to fetus during pregnancy, resulting in a range of outcomes, including severe birth defects and fetal/infant death. Potential pathways of vertical transmission in utero have been proposed but remain undefined. Identifying the timing and routes of vertical transmission of ZIKV may help us identify when interventions would be most effective. Furthermore, understanding what barriers ZIKV overcomes to effect vertical transmission may help improve models for evaluating infection by other pathogens during pregnancy. To determine the pathways of vertical transmission, we inoculated 12 pregnant rhesus macaques with an African-lineage ZIKV at gestational day 30 (term is 165 days). Eight pregnancies were surgically terminated at either seven or 14 days post-maternal infection. Maternal-fetal interface and fetal tissues and fluids were collected and evaluated with RT-qPCR, in situ hybridization for ZIKV RNA, immunohistochemistry, and plaque assays. Four additional pregnant macaques were inoculated and terminally perfused with 4% paraformaldehyde at three, six, nine, or ten days post-maternal inoculation. For these four cases, the entire fixed pregnant uterus was evaluated with in situ hybridization for ZIKV RNA. We determined that ZIKV can reach the MFI by six days post-infection and infect the fetus by ten days. Infection of the chorionic membrane and the extraembryonic coelomic fluid preceded infection of the fetus and the mesenchymal tissue of the placental villi. We did not find evidence to support a transplacental route of ZIKV vertical transmission via infection of syncytiotrophoblasts or villous cytotrophoblasts. The pattern of infection observed in the maternal-fetal interface provides evidence of vertical ZIKV transmission through the fetal membranes. Author’s Summary Zika virus (ZIKV) can be vertically transmitted from mother to fetus during pregnancy resulting in adverse pregnancy outcomes. For vertical transmission to occur, ZIKV must overcome the barriers of the maternal-fetal interface, yet the exact pathway ZIKV takes remains undefined. The maternal-fetal interface consists of the maternal decidua, the placenta, and the fetal membranes. ZIKV could reach the fetus through the placenta if it can infect the layer of cells that are directly exposed to maternal blood. ZIKV could also reach the fetus by infecting the decidua and then the adjacent fetal membranes. To determine the pathways of ZIKV vertical transmission, we infected pregnant macaques and evaluated ZIKV burden in the maternal-fetal interface and fetus shortly after maternal infection. The pattern of infection observed suggests that ZIKV vertically transmits through the fetal membranes, not the placenta. This finding is significant because it challenges the assumption that vertical transmission occurs exclusively across the placenta. By including the fetal membranes in our models of vertical transmission, we can more accurately determine which pathogens can be vertically transmitted. Ultimately, this study demonstrates that fetal membranes are an essential barrier to pathogens that warrant further investigation.

Abstract Infection with clade I Mpox virus (MPXV) results in adverse pregnancy outcomes, yet the potential for vertical transmission resulting in fetal harm with clade IIb MPXV, the clade that is currently circulating in the Western Hemisphere, remains unknown. We established a rhesus macaque model of vertical MPXV transmission with early gestation inoculation. Three pregnant rhesus macaques were inoculated intradermally with 1.5 × 10^5 plaque forming units (PFU) of clade IIb MPXV near gestational day (GD) 30 and animals were monitored for viremia and maternal and fetal well-being. Animals were euthanized to collect tissues at 5, 14, or 25 days post-inoculation (dpi). Tissues were evaluated for viral DNA (vDNA) loads, infectious virus titers, histopathology, MPXV mRNA and protein localization, as well as MPXV protein co-localization with placental cells including, Hofbauer cells, mesenchymal stromal cells, endothelial cells, and trophoblasts. vDNA was detected in maternal blood and skin lesions by 5 dpi. Lack of fetal heartbeat was observed at 14 or 25 dpi for two dams indicating fetal demise; the third dam developed significant vaginal bleeding at 5 dpi and was deemed an impending miscarriage. vDNA was detected in placental and fetal tissue in both fetal demise cases. MPXV localized to placental villi by ISH and IHC. Clade IIb MPXV infection in pregnant rhesus macaques results in vertical transmission to the fetus and adverse pregnancy outcomes, like clade I MPXV. Further studies are needed to determine whether antiviral therapy with tecovirimat will prevent vertical transmission and improve pregnancy outcomes. One Sentence Summary Clade IIb Mpox virus infection of pregnant rhesus macaques results in vertical transmission from mother to fetus and adverse pregnancy outcomes.

Abstract Background Congenital Zika virus (ZIKV) infection can result in birth defects, including malformations in the fetal brain and visual system. There are two distinct genetic lineages of ZIKV: African and Asian. Asian lineage ZIKVs have been associated with adverse pregnancy outcomes in humans; however, recent evidence from experimental models suggests that African-lineage viruses can also be vertically transmitted and cause fetal harm. Methodology/Principal Findings To evaluate the potential for vertical transmission of African-lineage ZIKV, we inoculated nine pregnant rhesus macaques ( Macaca mulatta ) subcutaneously with 44 plaque- forming units of a ZIKV strain from Senegal, (ZIKV-DAK). Dams were inoculated either at gestational day 30 or 45. Following maternal inoculation, pregnancies were surgically terminated seven or 14 days later and fetal and maternal-fetal interface tissues were collected and evaluated. Infection in the dams was evaluated via plasma viremia and neutralizing antibody titers pre- and post- ZIKV inoculation. All dams became productively infected and developed strong neutralizing antibody responses. ZIKV RNA was detected in maternal-fetal interface tissues (placenta, decidua, and fetal membranes) by RT-qPCR and in situ hybridization. In situ hybridization detected ZIKV predominantly in the decidua and revealed that the fetal membranes may play a role in ZIKV vertical transmission. Infectious ZIKV was detected in the amniotic fluid of three pregnancies and one fetus had ZIKV RNA detected in multiple tissues. No significant pathology was observed in any fetus; however, we did find an increase in the occurrence of decidual vasculitis and necrosis in ZIKV-exposed pregnancies compared to gestational-age-matched controls. Conclusions/Significance This study demonstrates that African-lineage ZIKV, like Asian-lineage ZIKV, can be vertically transmitted to the macaque fetus during pregnancy. The low inoculating dose used in this study suggests a low minimal infectious dose for rhesus macaques. Vertical transmission with a low dose in macaques further supports the high epidemic potential of African ZIKV strains. Author Summary Zika virus infection during pregnancy can result in adverse pregnancy outcomes including birth defects and miscarriage. There are two distinct genetic backgrounds of Zika virus: Asian-lineage and African-lineage. Currently, only Asian-lineage Zika virus is causally associated with adverse pregnancy outcomes in people. However, experimental studies have shown that African-lineage Zika virus can infect the fetus during pregnancy and cause adverse outcomes. Adverse pregnancy outcomes may not be associated with infection in people until there is an outbreak in a naive population. Thus, as African-lineage Zika virus continues to spread globally, the risk that it may pose to pregnant people remains a public health concern. In this study, we demonstrate that African-lineage Zika virus can be transmitted from the mother to the fetus during pregnancy. This study is significant because we used rhesus macaques, an animal that shares many key elements of Zika virus infection in pregnant people. This study is also significant because we inoculated pregnant macaques with a very small amount of virus, suggesting that fetal infection reported in previously published macaque studies is not limited to high-dose inoculation.

Background: Understanding gait development is essential for identifying motor impairments in neurodevelopmental disorders. Defining typical gait development in a rhesus macaque model is critical prior to characterizing abnormal gait. The goal of this study was to 1) explore the feasibility of using the Noldus Catwalk to assess gait in infant rhesus macaques and 2) provide preliminary normative data of gait development during the first month of life. New method: The Noldus Catwalk was used to assess gait speed, dynamic and static paw measurements, and interlimb coordination in twelve infant rhesus macaques at 14, 21, and 28 days of age. All macaque runs were labeled as a diagonal or non-diagonal walking pattern. Results: Infant rhesus macaques primarily used a diagonal (mature) walking pattern as early as 14 days of life. Ten infant rhesus macaques (83.3%) were able to successfully walk across the Noldus Catwalk at 28 days of life. Limited differences in gait parameters were observed between timepoints because of the variability within the group at 14, 21, and 28 days. Comparison with existing methods: No prior gait analysis system has been used to provide objective quantification of gait parameters for infant macaques. Conclusions: The Catwalk system can be utilized to quantify gait in infant rhesus macaques less than 28 days old. Future applications to infant rhesus macaques could provide a better understanding of gait development and early differences within various neurodevelopmental disorders.

One third of infants who have prenatal Zika virus (ZIKV) exposure and lack significant defects consistent with congenital Zika syndrome (CZS) manifest neurodevelopmental deficits in their second year of life. We hypothesized that prenatal ZIKV exposure would lead to brain abnormalities and neurodevelopmental delays in infant macaques, as measured by quantitative hearing, neurodevelopmental, ocular and brain imaging studies. We inoculated 5 pregnant rhesus macaques with ZIKV during the first trimester, monitored pregnancies with serial ultrasounds, determined plasma viral RNA (vRNA) loads, and evaluated the infants for birth defects and neurodevelopmental deficits during their first week of life. ZIKV-exposed and control infants (n=16) were evaluated with neurobehavioral assessments, ophthalmic examinations, optical coherence tomography, electroretinography with visual evoked potentials, hearing examinations, magnetic resonance imaging (MRI) of the brain, gross post mortem examination, and histopathological and vRNA analyses of approximately 40 tissues and fluids. All 5 dams had ZIKV vRNA in plasma and seroconverted following ZIKV inoculation. One pregnancy resulted in a stillbirth. The ZIKV-exposed infants had decreased cumulative feeding volumes and weight gains compared with control infants, and also had grey matter abnormalities in the pharyngeal motor cortex identified by quantitative voxel-based morphometric comparisons. Quantitative ocular studies identified differences between ZIKV-exposed and control infants in retinal layer thicknesses and electroretinograms that were not identified in qualitative ophthalmic evaluations. Despite these findings of neuropathology, no ZIKV vRNA or IgM was detected in the infants. This suggests that ZIKV exposure without measurable vertical transmission can affect brain development in utero and that subtle neurodevelopmental delays may be detected with quantitative analyses in early infancy. Quantitative brain analyses, such as these, may predict neurodevelopmental delays that manifest later in childhood and allow early intervention and targeted therapies to improve functional outcomes of ZIKV exposed children.

ABSTRACT Concerns have arisen that pre-existing immunity to dengue virus (DENV) could enhance Zika virus (ZIKV) disease, due to the homology between ZIKV and DENV and the observation of antibody-dependent enhancement (ADE) among DENV serotypes. To date, no study has examined the impact of pre-existing DENV immunity on ZIKV pathogenesis during pregnancy in a translational non-human primate model. Here we show that prior DENV-2 exposure enhanced ZIKV infection of maternal-fetal interface tissues in macaques. However, pre-existing DENV immunity had no detectable impact on ZIKV replication kinetics in maternal plasma, and all pregnancies progressed to term without adverse outcomes or gross fetal abnormalities detectable at delivery. Understanding the risks of ADE to pregnant women worldwide is critical as vaccines against DENV and ZIKV are developed and licensed and as DENV and ZIKV continue to circulate.