Hyperexcitability in the orbitofrontal cortex (OFC) is a key clinical feature of anhedonic domains of Major Depressive Disorder (MDD). However, the cellular and molecular substrates underlying this dysfunction remain unknown. Here, cell-population-specific chromatin accessibility profiling in human OFC unexpectedly mapped genetic risk for MDD exclusively to non-neuronal cells, and transcriptomic analyses revealed significant glial dysregulation in this region. Characterization of MDD-specific cis-regulatory elements identified ZBTB7A - a transcriptional regulator of astrocyte reactivity - as an important mediator of MDD-specific chromatin accessibility and gene expression. Genetic manipulations in mouse OFC demonstrated that astrocytic Zbtb7a is both necessary and sufficient to promote behavioral deficits, cell-type-specific transcriptional and chromatin profiles, and OFC neuronal hyperexcitability induced by chronic stress - a major risk factor for MDD. These data thus highlight a critical role for OFC astrocytes in stress vulnerability and pinpoint ZBTB7A as a key dysregulated factor in MDD that mediates maladaptive astrocytic functions driving OFC hyperexcitability.

Abstract Synonymous and noncoding single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the KCNJ6 gene, encoding G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK2) channel subunit 2, have been linked with increased electroencephalographic frontal theta event-related oscillations (ERO) in subjects diagnosed with alcohol use disorder (AUD). To identify molecular and cellular mechanisms while retaining the appropriate genetic background, we generated induced excitatory glutamatergic neurons (iN) from iPSCs derived from four AUD-diagnosed subjects with KCNJ6 variants (‘Affected: AF’) and four control subjects without variants (‘Unaffected: UN’). Neurons were analyzed for changes in gene expression, morphology, excitability and physiological properties. Single cell RNA sequencing suggests that KCNJ6 AF variant neurons have altered patterns of synaptic transmission and cell projection morphogenesis. Results confirm that AF neurons express lower levels of GIRK2, have greater neurite area, and elevated excitability. Interestingly, exposure to intoxicating concentrations of ethanol induces GIRK2 expression and reverses functional effects in AF neurons. Ectopic overexpression of GIRK2 alone mimics the effect of ethanol to normalize induced excitability. We conclude that KCNJ6 variants decrease GIRK2 expression and increase excitability and that this effect can be minimized or reduced with ethanol.

Genome-wide association analysis of electroencephalographic endophenotypes for alcohol use disorder has identified non-coding polymorphisms within the KCNJ6 gene. KCNJ6 encodes the GIRK2 protein, a subunit of a G-protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel that regulates neuronal excitability. To elucidate how GIRK2 affects neuronal excitability and the response to ethanol exposure, we upregulated KCNJ6 in human glutamatergic neurons derived from induced pluripotent stem cells using two distinct strategies: CRISPRa induction and lentiviral expression. Multi-electrode-arrays, calcium imaging, patch-clamp electrophysiology, and mitochondrial stress tests collectively show that elevated GIRK2 acts in concert with 7-21 days of ethanol exposure to inhibit neuronal activity, to counteract ethanol-induced increases in glutamate sensitivity, and to promote an increase intrinsic excitability. Furthermore, ethanol exposure did not alter basal nor activity-dependent mitochondrial respiration in elevated GIRK2 neurons. These data highlight a role for GIRK2 in mitigating the effects of ethanol on neuronal glutamatergic signaling and mitochondrial activity.