Tumor-associated neutrophil (TAN) effects on glioblastoma biology remain under-characterized. We show here that 'hybrid' neutrophils with dendritic features - including morphological complexity, expression of antigen presentation genes, and the ability to process exogenous peptide and stimulate MHCII-dependent T cell activation - accumulate intratumorally and suppress tumor growth in vivo . Trajectory analysis of patient TAN scRNA-seq identifies this phenotype as a polarization state which is distinct from canonical cytotoxic TANs and differentiates intratumorally from immature precursors absent in circulation. Rather, these hybrid-inducible immature neutrophils - which we identified in patient and murine glioblastomas - arise from local skull marrow. Through labeled skull flap transplantation and targeted ablation, we characterize calvarial marrow as a potent contributor of antitumoral myeloid APCs, including hybrid TANs and dendritic cells, which elicit T cell cytotoxicity and memory. As such, agents augmenting neutrophil egress from skull marrow - such as intracalvarial AMD3100 whose survival prolonging-effect in GBM we demonstrate - present therapeutic potential.

Abstract As breast cancer migrates into the brain, it acquires distinct genomic, immunologic and phenotypic changes through interactions with the local microenvironment. We sought to determine how targetable gene expression changes mediate breast cancer extravasation into and proliferation within the brain. We created a brain metastatic cell line (“brain-seeking”) via serial intracardiac injection of mCherry+ 4T1 breast cancer cells in Balb/c mice and flow cytometry isolation of micrometastases. We conducted in vitro and in-vivo studies to uncover immunological and genetic differences between primary breast cancer and brain metastases. In culture, we observed significant upregulation in adhesion (p=0.01) and invasion (p=0.0004) along with upregulation of adhesion-promoting genes such as Sdc3, Serpine2 or ECM1 in the brain-seeking cells. We observed significant differences in survival of Balb/c mice injected intracranially with brain-seeking cells compared to the 4T1 breast cancer cells (p=0.04). In the mammary fat pad (MFP), parental 4T1 cells caused increased mortality compared to brain-seeking cells (p=0.003). This rejection of brain-seeking 4T1 cells in the MFP could be due to their prior adaptation to the brain microenvironment, while rejection of parental 4T1 cells in the brain microenvironment could be due to them lacking those adaptations. Consistent with this finding, of 20,382 analyzed genes in both cell lines, 108 related to immune regulation were significantly upregulated in brain-seeking cells including Cxcl1, Dusp1, C3. Flow cytometry showed increased cytotoxic and helper T cells in intracranially injected parental 4T1 cells vs. brain-seeking cells (p <0.001). In the MFP, however, 4T1 parental cells displayed CD3+ T cell depletion and an increased number of neutrophils (p <0.05) while the “brain-seeking cells” showed increased numbers of CD3+ and CD4+ cells (p <0.01) and macrophages (p<0.05). These findings suggest that brain metastases evolve from their primary tumor through adhesive and invasive adaptations promoting extravasation, along with unique immunological adaptations that allow them to proliferate free of immune surveillance in the brain microenvironment.

While the poor prognosis of glioblastoma arises from the invasion of a subset of tumor cells, little is known of the metabolic alterations within these cells that fuel invasion. We integrated spatially addressable hydrogel biomaterial platforms, patient site-directed biopsies, and multi-omics analyses to define metabolic drivers of invasive glioblastoma cells. Metabolomics and lipidomics revealed elevations in the redox buffers cystathionine, hexosylceramides, and glucosyl ceramides in the invasive front of both hydrogel-cultured tumors and patient site-directed biopsies, with immunofluorescence indicating elevated reactive oxygen species (ROS) markers in invasive cells. Transcriptomics confirmed upregulation of ROS-producing and response genes at the invasive front in both hydrogel models and patient tumors. Amongst oncologic ROS, hydrogen peroxide specifically promoted glioblastoma invasion in 3D hydrogel spheroid cultures. A CRISPR metabolic gene screen revealed cystathionine gamma lyase (CTH), which converts cystathionine to the non-essential amino acid cysteine in the transsulfuration pathway, to be essential for glioblastoma invasion. Correspondingly, supplementing CTH knockdown cells with exogenous cysteine rescued invasion. Pharmacologic CTH inhibition suppressed glioblastoma invasion, while CTH knockdown slowed glioblastoma invasion in vivo. Our studies highlight the importance of ROS metabolism in invasive glioblastoma cells and support further exploration of the transsulfuration pathway as a mechanistic and therapeutic target.