ABSTRACT Bacillus subtilis produces a wide range of secondary metabolites providing diverse plant-growth-promoting and biocontrol abilities. These secondary metabolites include non-ribosomal peptides (NRPs) with strong antimicrobial properties, causing either cell lysis, pore formation in fungal membranes, inhibition of certain enzymes, or bacterial protein synthesis. However, the natural products of B. subtilis are mostly studied either in laboratory strains or in individual isolates and therefore, a comparative overview of B. subtilis secondary metabolites is missing. In this study, we have isolated 23 B. subtilis strains from eleven sampling sites, compared the fungal inhibition profiles of wild types and their NRPs mutants, followed the production of targeted lipopeptides, and determined the complete genomes of 13 soil isolates. We discovered that non-ribosomal peptide production varied among B. subtilis strains co-isolated from the same soil samples. In vitro antagonism assays revealed that biocontrol properties depend on the targeted plant pathogenic fungus and the tested B. subtilis isolate. While plipastatin alone is sufficient to inhibit Fusarium sp., a combination of plipastatin and surfactin is required to hinder the growth of Botrytis cinerea . Detailed genomic analysis revealed that altered NRP production profiles in certain isolates is due to missing core genes, nonsense mutation, or potentially altered gene regulation. Our study combines microbiological antagonism assays with chemical NRPs detection and biosynthetic gene cluster predictions in diverse B. subtilis soil isolates to provide a broader overview of the secondary metabolite chemodiversity of B. subtilis . IMPORTANCE Secondary or specialized metabolites with antimicrobial activities define the biocontrol properties of microorganisms. Members of the Bacillus genus produce a plethora of secondary metabolites, of which non-ribosomally produced lipopeptides in particular display strong antifungal activity. To facilitate prediction of the biocontrol potential of new Bacillus subtilis isolates, we have explored the in vitro antifungal inhibitory profiles of recent B. subtilis isolates, combined with analytical natural product chemistry, mutational analysis, and detailed genome analysis of biosynthetic gene clusters. Such a comparative analysis helped to explain why selected B. subtilis isolates lack production of certain secondary metabolites.

Abstract Bacterial-fungal interactions influence microbial community performance of most ecosystems and elicit specific microbial behaviours, including stimulating specialised metabolite production. Here, we use a co-culture experimental evolution approach to investigate bacterial adaptation to the presence of a fungus, using a simple model of bacterial-fungal interactions encompassing the bacterium Bacillus subtilis and the fungus Aspergillus niger . We find in one evolving population that B. subtilis was selected for enhanced production of the lipopeptide surfactin and accelerated surface spreading ability, leading to inhibition of fungal expansion and acidification of the environment. These phenotypes were explained by specific mutations in the DegS-DegU two-component system. In the presence of surfactin, fungal hyphae exhibited bulging cells with delocalised secretory vesicles possibly provoking an RlmA-dependent cell wall stress. Thus, our results indicate that the presence of the fungus selects for increased surfactin production, which inhibits fungal growth and facilitates the competitive success of the bacterium.

Abstract Bacterial secondary metabolites are structurally diverse molecules that drive microbial interaction by altering growth, cell differentiation, and signaling. Bacillus subtilis , a Gram-positive soil-dwelling bacterium, produces a wealth of secondary metabolites, among them, lipopeptides have been vastly studied by their antimicrobial, antitumor, and surfactant activities. However, the natural functions of secondary metabolites in the lifestyles of the producing organism remain less explored under natural conditions, i.e. in soil. Here, we describe a hydrogel-based transparent soil system to investigate B. subtilis chemical ecology under controllable soil-like conditions. The transparent soil matrix allows the growth of B. subtilis and other isolates gnotobiotically and under nutrient-controlled conditions. Additionally, we show that transparent soil allows the detection of lipopeptides production and dynamics by HPLC-MS and MALDI-MS imaging, along with fluorescence imaging of 3-dimensional bacterial assemblages. We anticipate that this affordable and highly controllable system will promote bacterial chemical ecology research and help to elucidate microbial interactions driven by secondary metabolites.

Abstract Bacterial-fungal interactions (BFIs) influence microbial community performance of most ecosystems and elicit specific microbial behaviours, including stimulating specialised metabolite production. Using a simple BFI system encompassing the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis and the black mould fungus Aspergillus niger , we established a co-culture experimental evolution method to investigate bacterial adaptation to the presence of a fungus. In the evolving populations, B. subtilis was rapidly selected for enhanced production of the lipopeptide surfactin and accelerated surface spreading ability, leading to inhibition of fungal expansion and acidification of the environment. These phenotypes were explained by specific mutations in the DegS-DegU two-component system. In the presence of surfactin, fungal hyphae exhibited bulging cells with delocalised secretory vesicles and RlmA-dependent cell wall stress induction. Increased surfactin production typically enhances the competitive success of bacteria against fungi, which likely explains the primary adaption path in the presence of A. niger . Significance statement Experimental evolution and co-cultivation of different microbes are important and useful techniques for discovering new traits and unravelling cryptic regulatory connections. We combined these methods by evolving the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in the presence of the black mould fungus Aspergillus niger that were previously shown to engage in an intricate and physical interaction. Both are ubiquitous, environmentally and industrially relevant model microbes in the colonisation of rhizo- and endosphere and in the production of enzymes. Our results demonstrate how laboratory adaptation can be exploited to improve biocontrol properties of bacteria.

Abstract The role of antagonistic secondary metabolites produced by Pseudomonas protegens in suppression of soil-borne phytopathogens has been clearly documented. However, their contribution to the ability of P. protegens to establish in soil and rhizosphere microbiomes remains less clear. Here, we use a four-species synthetic community (SynCom) in which individual members are sensitive towards key P. protegens antimicrobial metabolites (DAPG, pyoluteorin, and orfamide A) to determine how antibiotic production contributes to P. protegens community invasion and to identify community traits that counteract the antimicrobial effects. We show that P. protegens readily invades and alters the SynCom composition over time, and that P. protegens establishment requires production of DAPG and pyoluteorin. An orfamide A-deficient mutant of P. protegens invades the community as efficiently as wildtype, and both cause similar perturbations to community composition. Here, we identify the microbial interactions underlying the absence of an orfamide A mediated impact on the otherwise antibiotic-sensitive SynCom member, and show that the cyclic lipopeptide is inactivated and degraded by the combined action of Rhodococcus globerulus D757 and Stenotrophomonas indicatrix D763. Altogether, the demonstration that the synthetic community constrains P. protegens invasion by detoxifying its antibiotics may provide a mechanistic explanation to inconsistencies in biocontrol effectiveness in situ.

Abstract The role of antagonistic secondary metabolites produced by Pseudomonas protegens in suppression of soil-borne phytopathogens has been clearly documented. However, their contribution to the ability of P. protegens to establish in soil and rhizosphere microbiomes remains ambiguous. Here, we use a four-species synthetic community to determine how antibiotic production contributes to P. protegens community invasion and identify community traits that alter the abundance of key P. protegens antimicrobial metabolites (DAPG, pyoluteorin and orfamide A). Surprisingly, mutants deficient in antimicrobial production caused similar perturbations in community composition compared to invasion by wildtype P. protegens . Intriguingly, while pyoluteorin and orfamide A are secreted at levels toxic to individual bacterial strains, community-level resistance circumvents toxicity. Here, we identify the underlying mechanism by which the cyclic lipopeptide, orfamide A, is inactivated and degraded by Rhodococcus globerulus D757 and Stenotrophomonas indicatrix D763. Altogether, the demonstration that the synthetic community constrains P. protegens invasion by detoxifying its antibiotics may provide a mechanistic explanation to inconsistencies in biocontrol effectiveness in situ .

Abstract Secondary metabolites provide Bacillus subtilis with increased competitiveness towards other microorganisms. In particular nonribosomal peptides (NRPs) have an enormous antimicrobial potential by causing cell lysis, perforation of fungal membranes, enzyme inhibition or disruption of bacterial protein synthesis. This knowledge was primarily acquired in vitro when B. subtilis was competing with other microbial monocultures. However, our understanding of the true ecological role of these small molecules is limited. In this study, we have established soil-derived semi-synthetic mock communities containing 13 main genera and supplemented them with B. subtilis P5_B1 WT, its NRP deficient strain sfp or single NRP mutants incapable of producing surfactin, plipastatin or bacillaene. 16S amplicon sequencing revealed that the invasion of NRP-producing B. subtilis strains had no major impact on the bacterial communities. Still, the abundances of the two genera Lysinibacillus and Viridibacillus were reduced. Interestingly, this effect was diminished in communities supplemented with the NRPs deficient strain. Growth profiling of Lysinibacillus fusiformis M5 exposed to either spent media of the B. subtilis strains or pure surfactin indicates the sensitivity of this strain towards the biosurfactant surfactin. Our study provides a more in-depth insight into the influence of B. subtilis NRPs on semi-synthetic bacterial communities and helps to understand their ecological role.

Abstract Siderophores have long been implicated in sociomicrobiology as determinants of bacterial interrelations. For plant-associated genera like Bacillus and Pseudomonas , siderophores are well known for their biocontrol functions. Here, we explored the functional role of the Bacillus subtilis siderophore bacillibactin in an antagonistic interaction with Pseudomonas marginalis . The presence of bacillibactin strongly influenced the outcome of the interaction in an iron-dependent manner. The bacillibactin producer B. subtilis restricts colony spreading of P. marginalis by repressing the transcription of histidine kinase-encoding gene gacS , thereby abolishing production of secondary metabolites such as pyoverdine and viscosin. By contrast, lack of bacillibactin restricted B. subtilis colony growth in a mechanism reminiscent of a siderophore tug-of-war for iron. Our analysis revealed that the Bacillus-Pseudomonas interaction is conserved across fluorescent Pseudomonas spp., expanding our understanding of the interplay between two genera of the most well-studied soil microbes.

Abstract Soil bacteria are prolific producers of a myriad of biologically active secondary metabolites. These natural products play key roles in modern society, finding use as anti-cancer agents, as food additives, and as alternatives to chemical pesticides. As for their original role in interbacterial communication, secondary metabolites have been extensively studied under in vitro conditions, revealing a multitude of roles including antagonism, effects on motility, niche colonization, signaling, and cellular differentiation. Despite the growing body of knowledge on their mode of action, biosynthesis, and regulation, we still do not fully understand the role of secondary metabolites on the ecology of the producers and resident communities in situ. Here, we specifically examine the influence of Bacillus subtilis -produced cyclic lipopeptides (LPs) during the assembly of a bacterial synthetic community (SynCom), and simultaneously, explore the impact of LPs on B. subtilis establishment success in a SynCom propagated in an artificial soil microcosm. We found that surfactin production facilitates B. subtilis establishment success within multiple SynComs. Surprisingly, while neither a wild type nor a LP non-producer mutant had major impact on the SynCom composition over time, the B. subtilis and the SynCom metabolomes are both altered during co-cultivation. Overall, our work demonstrates the importance of surfactin production in microbial communities, suggesting a broad spectrum of action of this natural product.

Abstract Although not essential for their growth, the production of secondary metabolites increases the fitness of the producing microorganisms in their natural habitat by enhancing establishment, competition and nutrient acquisition. The Gram-positive soil-dwelling bacterium, Bacillus subtilis produces a variety of secondary metabolites. Here, we investigated the regulatory relationship between the non-ribosomal peptide surfactin and the sactipeptide bacteriocin subtilosin A. We discovered that B. subtilis mutants lacking surfactin production exhibited higher production of subtilosin A compared to their parental wild-type strain. Additionally, spatial visualization of B. subtilis production of metabolites demonstrated that surfactin secreted by a wild-type colony could suppress subtilosin A production in an adjacent mutant colony lacking surfactin production. Reporter assays were performed using mutants in specific transcriptional regulators that confirmed the role of ResD as an activator of the subtilosin A encoding BGC, while removal or Rok and AbrB repressors increased expression of the BGC that was further enhanced by additional deletion of surfactin, suggesting that a so far unidentified regulator might mediate the influence of surfactin on production of subtilosin A. Our study reveals a regulatory influence of one secondary metabolite on another, highlighting that the function of secondary metabolites could be more complex than its influence on other organisms and interactions among secondary metabolites could also contribute to their ecological significance. Importance Secondary metabolites play an important role in the life of microorganisms facilitating their fitness in the environment, including competing against other microorganisms, interacting with their host or environment, and allowing expansion in their environment. However, secondary metabolites also function as cue molecules influencing gene expression between and within species. Here, we describe that the non-ribosomally synthesized peptide surfactin repress the production of ribosomally synthesized and post translationally modified peptide, subtilosin A in Bacillus subtilis , revealing an ecological interaction between two secondary metabolites that could potentially influence the biocontrol efficiency of B. subtilis strain that depends on the production of these secondary metabolites against plant pathogen microorganisms.