Ischemic stroke results in a loss of tissue homeostasis and integrity, the underlying pathobiology of which stems primarily from the depletion of cellular energy stores and perturbation of available metabolites 1 . Hibernation in thirteen-lined ground squirrels (TLGS), Ictidomys tridecemlineatus , provides a natural model of ischemic tolerance as these mammals undergo prolonged periods of critically low cerebral blood flow without evidence of central nervous system (CNS) damage 2 . Studying the complex interplay of genes and metabolites that unfolds during hibernation may provide novel insights into key regulators of cellular homeostasis during brain ischemia. Herein, we interrogated the molecular profiles of TLGS brains at different time points within the hibernation cycle via RNA sequencing coupled with untargeted metabolomics. We demonstrate that hibernation in TLGS leads to major changes in the expression of genes involved in oxidative phosphorylation and this is correlated with an accumulation of the tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates citrate, cis-aconitate, and α-ketoglutarate-αKG. Integration of the gene expression and metabolomics datasets led to the identification of succinate dehydrogenase (SDH) as the critical enzyme during hibernation, uncovering a break in the TCA cycle at that level. Accordingly, the SDH inhibitor dimethyl malonate (DMM) was able to rescue the effects of hypoxia on human neuronal cells in vitro and in mice subjected to permanent ischemic stroke in vivo . Our findings indicate that studying the regulation of the controlled metabolic depression that occurs in hibernating mammals may lead to novel therapeutic approaches capable of increasing ischemic tolerance in the CNS.

Abstract To overcome oxidative, inflammatory, and metabolic stress, cells have evolved networks of cytoprotective proteins controlled by nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2) and its main negative regulator the Kelch-like ECH associated protein 1 (Keap1). Here, we used high-resolution mass-spectrometry to characterize the proteomes of macrophages with genetically altered Nrf2 status. Our analysis revealed significant differences among the genotypes in cellular metabolism and redox homeostasis, which we validated with respirometry and metabolomics, as well as in anti-viral immune pathways and the cell cycle. Nrf2 status significantly affected the proteome following lipopolysaccharide (LPS) stimulation, with alterations in redox, carbohydrate and lipid metabolism, and innate immunity observed. Of note, Nrf2 activation was found to promote mitochondrial fusion in inflammatory macrophages. The Keap1 inhibitor, 4-octyl itaconate (4-OI), a derivative of the mitochondrial immunometabolite itaconate, remodeled the inflammatory macrophage proteome, increasing redox and suppressing anti-viral immune effectors in a Nrf2-dependent manner. These data suggest that Nrf2 activation facilitates metabolic reprogramming and mitochondrial adaptation, and finetunes the innate immune response in macrophages. Graphical abstract Highlights First high-resolution proteome of macrophages with genetically altered Nrf2 status Nrf2 is key regulator of macrophage redox and intermediary metabolism Nrf2 finetunes the inflammatory response suppressing anti-viral immune and cytokine effectors, whilst promoting T cell activation factors Nrf2 regulates mitochondrial adaptation in inflammatory macrophages promoting the formation of a fused network 4-octyl itaconate (4-OI) suppresses anti-viral immune effectors in inflammatory macrophages in a Nrf2-dependent manner