The parasite Plasmodium falciparum is responsible for hundreds of millions of cases of malaria, and kills more than one million African children annually. Here we report an analysis of the genome sequence of P. falciparum clone 3D7. The 23-megabase nuclear genome consists of 14 chromosomes, encodes about 5,300 genes, and is the most (A + T)-rich genome sequenced to date. Genes involved in antigenic variation are concentrated in the subtelomeric regions of the chromosomes. Compared to the genomes of free-living eukaryotic microbes, the genome of this intracellular parasite encodes fewer enzymes and transporters, but a large proportion of genes are devoted to immune evasion and host–parasite interactions. Many nuclear-encoded proteins are targeted to the apicoplast, an organelle involved in fatty-acid and isoprenoid metabolism. The genome sequence provides the foundation for future studies of this organism, and is being exploited in the search for new drugs and vaccines to fight malaria.

The human malaria parasite Plasmodium vivax is responsible for 25–40% of the ∼515 million annual cases of malaria worldwide. Although seldom fatal, the parasite elicits severe and incapacitating clinical symptoms and often causes relapses months after a primary infection has cleared. Despite its importance as a major human pathogen, P. vivax is little studied because it cannot be propagated continuously in the laboratory except in non-human primates. We sequenced the genome of P. vivax to shed light on its distinctive biological features, and as a means to drive development of new drugs and vaccines. Here we describe the synteny and isochore structure of P. vivax chromosomes, and show that the parasite resembles other malaria parasites in gene content and metabolic potential, but possesses novel gene families and potential alternative invasion pathways not recognized previously. Completion of the P. vivax genome provides the scientific community with a valuable resource that can be used to advance investigation into this neglected species. Four distinct Plasmodium species are known to regularly infect humans: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae and P. ovale. The genome sequence of P. falciparum, the cause of the most severe type of human malaria, was completed in 2002 at the same time as the mosquito vector, Anopheles gambiae. In this week's Nature, which focuses on the malaria parasite, two further malaria genome sequences are described. First that of P. vivax, which contributes significant numbers to malaria incidence in humans, though in contrast to P. falciparum, the resulting disease is usually not fatal. The genome of this rather neglected species is presented together with a comparative analysis with the genomes of other Plasmodium species. Second, we publish the genome sequence of Plasmodium knowlesi. For long regarded as a monkey malaria parasite, it is increasingly becoming recognized as the fifth human-infecting Plasmodium species. In particular, it is prevalent in South East Asia where it is often misdiagnosed as another human malaria parasite P. malariae. As a model organism P. knowlesi stands out: not only is it a primate system, useful for work on vaccines, but it can be cultured in vitro and subjected to efficient transfection and gene knockouts. In a Review Article, Elizabeth Winzeler considers the progress made towards using the genome sequence to understand basic malaria parasite biology, and in particular the work on developing rational therapeutic approaches to combat P. falciparum infections. See also the Editorial. For a comprehensive collection of resources visit Nature's past malaria specials: Malaria killer blow ; Outlook on malaria ; Malaria web focus ; Malaria Insight ; Nature Medicine focus on malaria ; Focus on malaria

Malaria parasites use antigenic variation to avoid immune clearance and increase the duration of infection in the human host. Variation at the surface of P. falciparum-infected erythrocytes is mediated by the differential control of a family of surface antigens encoded by var genes. Switching of var gene expression occurs in situ, mostly from telomere-associated loci, without detectable DNA alterations, suggesting that it is controlled by chromatin structure. We have identified chromatin modifications at telomeres that spread far into telomere-proximal regions, including var gene loci (>50 kb). One type of modification is mediated by a protein homologous to yeast Sir2 called PfSir2, which forms a chromosomal gradient of heterochromatin structure and histone hypoacetylation. Upon activation of a specific telomere-associated var gene, PfSir2 is removed from the promoter region and acetylation of histone occurs. Our data demonstrate that mutually exclusive transcription of var genes is linked to the dynamic remodeling of chromatin.

Transit peptides mediate protein targeting into plastids and are only poorly understood. We extracted amino acid features from transit peptides that target proteins to the relict plastid (apicoplast) of malaria parasites. Based on these amino acid characteristics, we identified 466 putative apicoplast proteins in the Plasmodium falciparum genome. Altering the specific charge characteristics in a model transit peptide by site-directed mutagenesis severely disrupted organellar targeting in vivo. Similarly, putative Hsp70 (DnaK) binding sites present in the transit peptide proved to be important for correct targeting.

Erythrocyte invasion by the merozoite is an obligatory stage in Plasmodium parasite infection and essential to malaria disease progression. Attempts to study this process have been hindered by the poor invasion synchrony of merozoites from the only in vitro culture-adapted human malaria parasite, Plasmodium falciparum. Using fluorescence, three-dimensional structured illumination, and immunoelectron microscopy of filtered merozoites, we analyze cellular and molecular events underlying each discrete step of invasion. Monitoring the dynamics of these events revealed that commitment to the process is mediated through merozoite attachment to the erythrocyte, triggering all subsequent invasion events, which then proceed without obvious checkpoints. Instead, coordination of the invasion process involves formation of the merozoite-erythrocyte tight junction, which acts as a nexus for rhoptry secretion, surface-protein shedding, and actomyosin motor activation. The ability to break down each molecular step allows us to propose a comprehensive model for the molecular basis of parasite invasion.

Abstract The World Health Organisation (WHO) recommends artemisinin (ART) combinations for treatment of uncomplicated Plasmodium falciparum malaria. Understanding the interaction between co-administered drugs within combination therapies is clinically important to prevent unintended consequences. The WHO guidelines recommend second line treatments that combine artesunate with tetracycline, doxycycline, or clindamycin—antibiotics that target the Plasmodium relict plastid, the apicoplast. In addition, antibiotics can be used simultaneously against other infectious diseases, leading to their inadvertent combination with ARTs. One consequence of apicoplast inhibition is a perturbation to haemoglobin uptake and trafficking—a pathway required for activation of ART derivatives. Here, we show that apicoplast-targeting antibiotics reduce the abundance of the catalyst of ART activation (free haem) in P. falciparum , likely through diminished haemoglobin digestion. We demonstrate antagonism between ART and these antibiotics, suggesting that apicoplast inhibitors reduce ART activation. These data have potential clinical implications due to the reliance on—and widespread use of—both ARTs and these antibiotics in malaria endemic regions.

Abstract The splicing of mRNA constitutes a major source of co- and post-transcriptional regulation in metazoans. In particular, members of the serine/arginine (SR) protein family are essential splicing factors that are implicated in the regulation of gene expression and RNA metabolism. However, very little is known about these proteins in apicomplexans, a phylum that includes some of the most important global parasites. In this study, we investigated the suite of three uncharacterised SR proteins in Toxoplasma gondii and show that all three are found localised to nuclear speckles. We show, by genetic ablation, that Tg SR1 is particularly important for T. gondii growth. Using RNA-seq, we also characterised the global gene expression and splicing regulation of these proteins. We find that the SR proteins regulate several types of alternative splicing of distinct but overlapping subsets of transcripts, as well as impacting transcript abundance. Most of the alternative splicing events are non-productive intron retention events that do not appear to affect transcript abundance. The splicing sites of the impacted transcripts are enriched in characteristic SR binding motifs. We also identified and conditionally knocked down two putative kinases of SR proteins. The kinases are localised to nuclear speckles and are essential to parasite survival. Their perturbation resulted in widespread changes to splicing, but the affected transcripts did not mirror the patterns seen in knockouts of individual SRs, suggesting an absence of a simple relationship between SRs and these putative kinase regulators. Overall, this study reveals a complex system of splicing factors and kinases that post-transcriptionally regulate gene expression in T. gondii .

ABSTRACT Nonsense-mediated decay (NMD) is a conserved mRNA quality control process that eliminates transcripts bearing a premature termination codon. In addition to its role in removing erroneous transcripts, NMD is involved in post-transcriptional regulation of gene expression via programmed intron retention in metazoans. The apicomplexan parasite Plasmodium falciparum shows relatively high levels of intron retention, but it is unclear whether these variant transcripts are functional targets of NMD. In this study, we use CRISPR-Cas9 to disrupt and epitope-tag two core NMD components: Pf UPF1 (PF3D7_1005500) and Pf UPF2 (PF3D7_0925800). Using RNA-seq, we find that NMD in P. falciparum is highly derived and requires UPF2, but not UPF1 for transcript degradation. Furthermore, our work suggests that the majority of intron retention in P. falciparum has no functional role and that NMD is not required for parasite growth ex vivo . We localise both Pf UPF1 and Pf UPF2 to puncta within the parasite cytoplasm, which may represent processing bodies - ribonucleoparticles that are sites of cytoplasmic mRNA decay. Finally, we identify a number of mRNA-binding proteins that co-immunoprecipitate with the NMD core complex and propose a model for a divergent NMD that does not require Pf UPF1 and incorporates novel accessory proteins to elicit mRNA decay.

Abstract Artemisinin (ART) is a quick-killing and effective antimalarial activated by the haem derived from haemoglobin digestion. Mutations in the parasite’s Kelch 13 (K13) protein compromise the efficacy of this drug. Recent studies indicate an undefined role for K13 in haemoglobin uptake. Here, we show that K13 is associated with the collar that constricts cytostomal invaginations required for the parasite to ingest host cytosol. Induced mislocalisation of K13 led to the formation of atypical invaginations lacking the cytostomal ring and constricted neck normally associated with cytostomes. Moreover, the levels of haemoglobin degradation products, haem and haemozoin, are decreased when K13 is inactivated. Our findings demonstrate that K13 is required for normal formation and/or stabilisation of the cytostome, and thereby the parasite’s uptake of haemoglobin. This is consistent with perturbation of K13 function leading to decreased activation of ART and consequently, reduced killing. Significance Statement Artemisinin-resistant parasites contain mutations in the gene encoding the Kelch 13 protein (K13). How K13 mutations result in artemisinin resistance is unclear. Here, we present evidence that normal K13 is required for the formation of the cytostome, a specialised parasite feeding apparatus used to endocytose host cell haemoglobin. Our results suggest that artemisinin resistance is due to a decrease in artemisinin activation brought about by a decrease in efficiency of haemoglobin uptake and consequently reduced production of haem.

Abstract Glycophosphatidylinositol (GPI) anchors are the predominant glycoconjugate in Plasmodium parasites, enabling modified proteins to associate with biological membranes. GPI biosynthesis commences with donation of a mannose residue held by dolichol-phosphate at the endoplasmic reticulum membrane. In Plasmodium dolichols are derived from isoprenoid precursors synthesised in the Plasmodium apicoplast, a relict plastid organelle of prokaryotic origin. We found that treatment of Plasmodium parasites with apicoplast inhibitors decreases the abundance of isoprenoid and GPI intermediates resulting in GPI-anchored proteins becoming untethered from their normal membrane association. Even when other isoprenoids were chemically rescued, GPI depletion led to an arrest in schizont stage parasites, which had defects segmentation and egress. In those daughter parasites (merozoites) that did form, proteins that would normally be GPI-anchored were mislocalised, and when these merozoites were artificially released they were able to attach to but not invade new red blood cells. Our data provides further evidence for the importance of GPI biosynthesis during the asexual cycle of P. falciparum , and indicates that GPI biosynthesis, and by extension egress and invasion, is dependent on isoprenoids synthesised in the apicoplast. Author summary The plastid apicoplast organelle of the malaria parasite Plasmodium falciparum has long been recognised as a drug target, however the downstream metabolic pathways have not been fully elucidated. In this study we inhibited apicoplast function in blood-stage P. falciparum and following the depletion of essential apicoplast-derived isoprenoids, we observed that these parasites exhaust their supplies of the polyisoprenoid alcohol dolichol. Dolichols form important components of biological membranes and are also required for the synthesis of the major parasite glycoconjugate, glycophosphatidylinositol (GPI) anchors. Concurrent with a reduction in dolichol levels, proteins normally conjugated to GPIs became mislocalised. Severe parasite impairments followed with incomplete membrane segmentation of their daughter merozoites, which could subsequently neither egress nor reinvade host red blood cells. Our data implicates dolichol as an essential parasite metabolite, dependent on normal apicoplast function, and reveals novel roles for GPI anchored proteins. The widespread phenotype following disrupted dolichol synthesis supports aspects of GPI biosynthesis as potential future drug targets.