ABSTRACT Polyphosphates (polyP) are chains of inorganic phosphates that can reach over 1000 residues in length. In Escherichia coli , polyP is produced by the polyP kinase (PPK) and is thought to play a protective role during the response to cellular stress. However, the molecular pathways impacted by PPK activity and polyP accumulation remain poorly characterized. In this work we used label-free mass spectrometry to study the response of bacteria that cannot produce polyP (Δ ppk ) during starvation to identify novel pathways regulated by PPK. In response to starvation, we found 92 proteins significantly differentially expressed between wild-type and Δ ppk mutant cells. Wild-type cells were enriched for proteins related to amino acid biosynthesis and transport, while Δppk mutants were enriched for proteins related to translation and ribosome biogenesis, suggesting that without PPK, cells remain inappropriately primed for growth even in the absence of required building blocks. From our dataset, we were particularly interested in Arn and EptA proteins, which were downregulated in Δ ppk mutants compared to wild-type controls, because they play a role in lipid A modifications linked to polymyxin resistance. Using western blotting, we confirm differential expression of these and related proteins, and provide evidence that this mis-regulation in Δ ppk cells stems from a failure to induce the BasS/BasR two-component system during starvation. We also show that Δ ppk mutants unable to upregulate Arn and EptA expression lack the respective L-Ara4N and pEtN modifications on lipid A. In line with this observation, loss of ppk restores polymyxin sensitivity in resistant strains carrying a constitutively active basR allele. Overall, we show a new role for PPK in lipid A modification during starvation and provide a rationale for targeting PPK to sensitize bacteria towards polymyxin treatment. We further anticipate that our proteomics work will provide an important resource for researchers interested in the diverse pathways impacted by PPK.

Inorganic polyphosphate (polyP) is a linear polymer of orthophosphate that is present in nearly all organisms studied to date. A remarkable function of polyP involves its attachment to lysine residues via non-enzymatic post-translational modification (PTM) that is presumed to be covalent. Here, we show that proteins containing tracts of consecutive histidine residues exhibit a similar modification by polyP, which confers an electrophoretic mobility shift on NuPAGE gels. Our screen uncovered 30 human and yeast histidine repeat proteins that are specifically modified by polyP. This polyP modification is histidine-dependent and non-covalent in nature, though remarkably, it withstands harsh denaturing conditions - a hallmark of covalent PTMs. We have termed this interaction ionic histidine polyphosphorylation (iH-PPn) to describe its unique PTM-like properties. Importantly, we show that iH-PPn disrupts phase separation and phosphorylation activity of the human protein kinase DYRK1A, and inhibits the activity of the transcription factor MafB, highlighting iH-PPn as a potential hitherto unrecognized regulatory mechanism.

Abstract Polyphosphates (PolyP) are composed of long chains of inorganic phosphates linked together by phosphoanhydride bonds. They are found in all kingdoms of life, playing roles in cell growth, infection, and blood coagulation. A resurgence in interest in polyP has shown links to diverse aspects of human disease. However, unlike in bacteria and lower eukaryotes, the mammalian enzymes responsible for polyP metabolism are not known. Many studies have resorted to adding polyP to cell culture media, but it is not clear if externally applied polyP enters the cell to impact signaling events or whether their effect is mediated exclusively by extracellular receptors. For the first time, we use RNA-seq and mass spectrometry to define a broad impact of polyP produced inside of mammalian cells via ectopic expression of the E. coli polyP synthetase Ppk1. RNA-seq demonstrates that Ppk1 expression impacts expression of over 350 genes enriched for processes related to transcription and cell motility. Analysis of proteins via label-free mass spectrometry identified over 100 changes with functional enrichment in cell migration. Follow up work suggests a role for internally-synthesized polyP in promoting activation of mTOR and ERK1/2-EGR1 signaling pathways implicated in cell growth and stress. Finally, fractionation analysis shows that polyP accumulated in multiple cellular compartments and was associated with the relocalization several nuclear/cytoskeleton proteins, including chromatin bound proteins DEK, TAF10, GTF2I and translation initiation factor eIF5b. Our work is the first to demonstrate that internally produced polyP can activate diverse signaling pathways in human cells. Significance Statement For many years following its discovery in 1890, polyphosphates (polyP) were dismissed as evolutionary fossils. Best understood for its role in bacteria and yeast, our understanding of polyP in mammals remains rudimentary because the enzymes that synthesize and degrade polyP in mammalian systems are currently unknown. In our work, we carried out large-scale transcriptome and proteome approaches on human cells designed to accumulate internally produced polyP via ectopic expression of a bacterial polyP synthetase. Our work is the first to systematically assess the impact of increased intracellular polyP.

ABSTRACT In diverse cells from bacterial to mammalian species, inorganic phosphate is stored in long chains called polyphosphates (polyP). These near universal polymers, ranging from 3 to thousands of phosphate moieties in length, are associated with molecular functions including energy homeostasis, protein folding, and cell signaling. In many cell types, polyphosphate is concentrated in subcellular compartments or organelles. In the budding yeast S. cerevisiae, polyP synthesis by the membrane-bound VTC complex is coupled to its translocation into the lumen of the vacuole, a lysosome-related organelle, where it is stored at high concentrations. In contrast, ectopic expression of bacterial polyphosphate kinase, PPK, results in the toxic accumulation of polyP outside of the vacuole. In this study, we used label-free mass spectrometry to investigate the mechanisms underlying this toxicity. We find that PPK expression results in the activation of a stress response mediated in part by the Hog1 and Yak1 kinases, and Msn2/Msn4 transcription factors. This response is countered by the combined action of the Ddp1 and Ppx1 polyphosphatases that function together to counter polyP accumulation and downstream toxicity. In contrast, ectopic expression of previously proposed mammalian polyphosphatases did not impact PPK-mediated toxicity in this model, suggesting either that these enzymes do not function directly as polyphosphatases in vivo or that they require co-factors unique to higher eukaryotes. Our work provides a mechanistic explanation for why polyP accumulation outside of lysosome-related organelles is toxic. Further, it serves as a resource for exploring how polyP may impact conserved biological processes at a molecular level.

ABSTRACT Polyphosphates (polyP) are energy-rich polymers of inorganic phosphates assembled into chains ranging from 3-1000s of residues in length. They are thought to exist in all cells on earth and play roles in an eclectic mix of functions ranging from phosphate homeostasis to cell signaling, infection control, and blood clotting. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae , polyP chains are synthesized by the vacuole-bound VTC complex, which synthesizes polyP while simultaneously translocating it into the vacuole lumen where it is stored at high concentrations. VTC’s activity is promoted by an accessory subunit called Vtc5. In this work, we find that the conserved AP-3 complex is required for proper Vtc5 localization to the vacuole membrane. In human cells, previous work has demonstrated that mutation of AP-3 subunits gives rise to Hermansky-Pudlak Syndrome, a rare disease with molecular phenotypes that include decreased polyP accumulation in platelet dense granules. In yeast AP-3 mutants, we find that Vtc5 is rerouted to the vacuole lumen by the ESCRT complex, where it is degraded by the vacuolar protease Pep4. Cells lacking functional AP-3 have decreased levels of polyP, demonstrating that membrane localization of Vtc5 is required for its VTC stimulatory activity in vivo . Our work provides insight into the molecular trafficking of a critical regulator of polyP metabolism in yeast. We speculate that AP-3 may also be responsible for the delivery of polyP regulatory proteins to platelet dense granules in higher eukaryotes. HIGHLIGHTS Vtc5 localization to the vacuole membrane depends on the AP-3 complex The ESCRT pathway brings mislocalized Vtc5 to the vacuole lumen where it is degraded Decreased polyP levels in AP-3 mutants are explained by Vtc5 mislocalization Deletion of DOA4 restores wild-type localization of Vtc5 without restoring polyP levels

Targeting MYC oncogene remains a major therapeutic goal in cancer chemotherapy. Here, we demonstrate that proscillaridin, a cardiac glycoside approved for heart failure treatment exhibit anticancer selectivity towards high MYC expressing leukemic cell lines and leukemia stem cells. At a clinically relevant concentration, proscillaridin induced a rapid downregulation of MYC protein level, due to a significant decrease in MYC protein half-life. Proscillaridin treatment induced a downregulation of gene sets involved in MYC pathway, and a concomitant upregulation of genes involved in hematopoietic differentiation. Proscillaridin induced a significant loss of lysine acetylation in histone H3 (at K9, K14, K18 and K27) and in non-histone proteins such as MYC, MYC target proteins, and a series of histone acetylation regulators. Loss of lysine acetylation correlated with a rapid downregulation of histone acetyltransferase protein levels, involved in histone and MYC acetylation (CBP, P300, GCN5, Tip60, and MOZ), preferentially in MYC overexpressing leukemia as compared to other cancer cells. These results support the repurposing of proscillaridin in MYC overexpressing leukemia and propose a novel strategy to target MYC in cancer.

Polyphosphates (polyP) are long chains of inorganic phosphates that can be attached to lysine residues of target proteins as a non-enzymatic post-translational modification. This modification, termed polyphosphorylation, may be particularly prevalent in bacterial and fungal species that synthesize and store large quantities of polyP. In this study, we applied a proven screening strategy to evaluate the polyphosphorylation status of over 200 candidate targets in the budding yeast S. cerevisiae. We report 8 new polyphosphorylated proteins that interact genetically and physically with a previously identified network of targets implicated in ribosome biogenesis. The expanded target network includes vacuolar proteins Prb1 and Apl5, whose modification with polyP suggests a model for feedback regulation of polyP synthesis, while raising additional questions regarding the location of polyphosphorylation in vivo.

Gcn5 and sirtuins are highly conserved HAT and HDAC enzymes that were first characterised as regulators of gene expression. Although histone tails are important substrates of these enzymes, these proteins also target many non-histone substrates that participate in diverse biological processes. The mechanisms used by these enzymes to choose their non-histone substrates is unclear. In this work, we use a unique synthetic biology approach in S. cerevisiae to demonstrate that a shared target sequence can act as a determinant of substrate selection for Gcn5 and sirtuins. We also exploit this system to define specific subunits of the Gcn5-containing ADA complex as regulators of non-histone acetylations proteome-wide.