Engineered myocardial tissues can be used to elucidate fundamental features of myocardial biology, develop organotypic in vitro model systems, and as engineered tissue constructs for replacing damaged heart tissue in vivo. However, a key limitation is an inability to test the wide range of parameters (cell source, mechanical, soluble and electrical stimuli) that might impact the engineered tissue in a high-throughput manner and in an environment that mimics native heart tissue. Here we used microelectromechanical systems technology to generate arrays of cardiac microtissues (CMTs) embedded within three-dimensional micropatterned matrices. Microcantilevers simultaneously constrain CMT contraction and report forces generated by the CMTs in real time. We demonstrate the ability to routinely produce ∼200 CMTs per million cardiac cells (<1 neonatal rat heart) whose spontaneous contraction frequency, duration, and forces can be tracked. Independently varying the mechanical stiffness of the cantilevers and collagen matrix revealed that both the dynamic force of cardiac contraction as well as the basal static tension within the CMT increased with boundary or matrix rigidity. Cell alignment is, however, reduced within a stiff collagen matrix; therefore, despite producing higher force, CMTs constructed from higher density collagen have a lower cross-sectional stress than those constructed from lower density collagen. We also study the effect of electrical stimulation on cell alignment and force generation within CMTs and we show that the combination of electrical stimulation and auxotonic load strongly improves both the structure and the function of the CMTs. Finally, we demonstrate the suitability of our technique for high-throughput monitoring of drug-induced changes in spontaneous frequency or contractility in CMTs as well as high-speed imaging of calcium dynamics using fluorescent dyes. Together, these results highlight the potential for this approach to quantitatively demonstrate the impact of physical parameters on the maturation, structure, and function of cardiac tissue and open the possibility to use high-throughput, low volume screening for studies on engineered myocardium.

Access to robust and information-rich human cardiac tissue models would accelerate drug-based strategies for treating heart disease. Despite significant effort, the generation of high-fidelity adult-like human cardiac tissue analogs remains challenging. We used computational modeling of tissue contraction and assembly mechanics in conjunction with microfabricated constraints to guide the design of aligned and functional 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues that we term cardiac microwires (CMWs). Miniaturization of the platform circumvented the need for tissue vascularization and enabled higher-throughput image-based analysis of CMW drug responsiveness. CMW tissue properties could be tuned using electromechanical stimuli and cell composition. Specifically, controlling self-assembly of 3D tissues in aligned collagen, and pacing with point stimulation electrodes, were found to promote cardiac maturation-associated gene expression and in vivo-like electrical signal propagation. Furthermore, screening a range of hPSC-derived cardiac cell ratios identified that 75% NKX2 Homeobox 5 (NKX2-5)+ cardiomyocytes and 25% Cluster of Differentiation 90 OR (CD90)+ nonmyocytes optimized tissue remodeling dynamics and yielded enhanced structural and functional properties. Finally, we demonstrate the utility of the optimized platform in a tachycardic model of arrhythmogenesis, an aspect of cardiac electrophysiology not previously recapitulated in 3D in vitro hPSC-derived cardiac microtissue models. The design criteria identified with our CMW platform should accelerate the development of predictive in vitro assays of human heart tissue function.

Abstract The ability to generate human pluripotent stem cell‐derived cell types at sufficiently high numbers and in a reproducible manner is fundamental for clinical and biopharmaceutical applications. Current experimental methods for the differentiation of pluripotent cells such as human embryonic stem cells (hESC) rely on the generation of heterogeneous aggregates of cells, also called “embryoid bodies” (EBs), in small scale static culture. These protocols are typically (1) not scalable, (2) result in a wide range of EB sizes and (3) expose cells to fluctuations in physicochemical parameters. With the goal of establishing a robust bioprocess we first screened different scalable suspension systems for their ability to support the growth and differentiation of hESCs. Next homogeneity of initial cell aggregates was improved by employing a micro‐printing strategy to generate large numbers of size‐specified hESC aggregates. Finally, these technologies were integrated into a fully controlled bioreactor system and the impact of oxygen concentration was investigated. Our results demonstrate the beneficial effects of stirred bioreactor culture, aggregate size‐control and hypoxia (4% oxygen tension) on both cell growth and cell differentiation towards cardiomyocytes. QRT‐PCR data for markers such as Brachyury, LIM domain homeobox gene Isl‐1, Troponin T and Myosin Light Chain 2v, as well as immunohistochemistry and functional analysis by response to chronotropic agents, documented the impact of these parameters on cardiac differentiation. This study provides an important foundation towards the robust generation of clinically relevant numbers of hESC derived cells. Biotechnol. Bioeng. 2009;102: 493–507. © 2008 Wiley Periodicals, Inc.

Although it has been observed that aggregate size affects cardiac development, an incomplete understanding of the cellular mechanisms underlying human pluripotent stem cell-derived cardiomyogenesis has limited the development of robust defined-condition cardiac cell generation protocols. Our objective was thus to elucidate cellular and molecular mechanisms underlying the endogenous control of human embryonic stem cell (hESC) cardiac tissue development, and to test the hypothesis that hESC aggregate size influences extraembryonic endoderm (ExE) commitment and cardiac inductive properties. hESC aggregates were generated with 100, 1000, or 4000 cells per aggregate using microwells. The frequency of endoderm marker (FoxA2 and GATA6)-expressing cells decreased with increasing aggregate size during early differentiation. Cardiogenesis was maximized in aggregates initiated from 1000 cells, with frequencies of 0.49±0.06 cells exhibiting a cardiac progenitor phenotype (KDRlow/C-KITneg) on day 5 and 0.24±0.06 expressing cardiac Troponin T on day 16. A direct relationship between ExE and cardiac differentiation efficiency was established by forming aggregates with varying ratios of SOX7 (a transcription factor required for ExE development) overexpressing or knockdown hESCs to unmanipulated hESCs. We demonstrate, in a defined, serum-free cardiac induction system, that robust and efficient cardiac differentiation is a function of endogenous ExE cell concentration, a parameter that can be directly modulated by controlling hESC aggregate size.

Abstract Three-dimensional (3D) in vitro models of human skeletal muscle mimic aspects of native tissue structure and function, thereby providing a promising system for disease modeling, drug discovery or pre-clinical validation, and toxicity testing. Widespread adoption of this research approach is hindered by the lack of easy-to-use platforms that are simple to fabricate and that yield arrays of human skeletal muscle micro-tissues (hMMTs) in culture with reproducible physiological responses that can be assayed non-invasively. Here, we describe a design and methods to generate a reusable mold to fabricate a 96-well platform, referred to as MyoTACTIC, that enables bulk production of 3D hMMTs. All 96-wells and all well features are cast in a single step from the reusable mold. Non-invasive calcium transient and contractile force measurements are performed on hMMTs directly in MyoTACTIC, and unbiased force analysis occurs by a custom automated algorithm, allowing for longitudinal studies of function. Characterizations of MyoTACTIC and resulting hMMTs confirms the capability of the device to support formation of hMMTs that recapitulate biological responses. We show that hMMT contractile force mirrors expected responses to compounds shown by others to decrease (dexamethasone, cerivastatin) or increase (IGF-1) skeletal muscle strength. Since MyoTACTIC supports hMMT long-term culture, we evaluated direct influences of pancreatic cancer chemotherapeutics agents on contraction competent human skeletal muscle myotubes. A single application of a clinically relevant dose of Irinotecan decreased hMMT contractile force generation, while clear effects on myotube atrophy were observed histologically only at a higher dose. This suggests an off-target effect that may contribute to cancer associated muscle wasting, and highlights the value of the MyoTACTIC platform to non-invasively predict modulators of human skeletal muscle function.

Abstract To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force and be amenable to standard multiwell-plate manipulations. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom 3D-print-molded multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a circumferential ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen, which, in response to the gradual slope of the circumferential ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells, and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated the contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable the measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

Embryonic stem cell (ESC) derivatives are a promising cell source for cardiac cell therapy. Mechanistic studies upon cell injection in conventional animal models are limited by inefficient delivery and poor cell survival. As an alternative, we have used an engineered heart tissue (EHT) based on neonatal rat cardiomyocytes (CMs) cultivated with electrical field stimulation as an in vitro model to study cell injection. We injected (0.001, 0.01, and 0.1 million) and tracked (by qPCR and histology) undifferentiated yellow-fluorescent protein transgenic mouse ESCs and Flk1 + /PDGFRα+ cardiac progenitor (CPs) cells, to investigate the effect of the cardiac environment on cell differentiation, as well as to test whether our in vitro model system could recapitulate the formation of teratoma-like structures commonly observed upon in vivo ESC injection. By 8 days post-injection, ESCs were spatially segregated from the cardiac cell population; however, ESC injection increased survival of CMs. The presence of ESCs blocked electrical conduction through the tissue, resulting in a 46% increase in the excitation threshold. Expression of mouse cardiac troponin I, was markedly increased in CP injected constructs compared to ESC injected constructs at all time points and cell doses tested. As early as 2 weeks, epithelial and ganglion-like structures were observed in ESC injected constructs. By 4 weeks of ESC injection, teratoma-like structures containing neural, epithelial, and connective tissue were observed in the constructs. Non-cardiac structures were observed in the CP injected constructs only after extended culture (4 weeks) and only at high cell doses, suggesting that these cells require further enrichment or differentiation prior to transplantation. Our data indicate that the cardiac environment of host tissue and electrical field stimulation did not preferentially guide the differentiation of ESCs towards the cardiac lineage. In the same environment, injection of CP resulted in a more robust cardiac differentiation than injection of ESC. Our data demonstrate that the model-system developed herein can be used to study the functional effects of candidate stem cells on the host myocardium, as well as to measure the residual activity of undifferentiated cells present in the mixture.

The hypoblast is an essential extraembryonic tissue set aside within the inner cell mass in the blastocyst. Research with human embryos is challenging. Thus, stem cell models that reproduce hypoblast differentiation provide valuable alternatives. We show here that human naive pluripotent stem cell (PSC) to hypoblast differentiation proceeds via reversion to a transitional ICM-like state from which the hypoblast emerges in concordance with the trajectory in human blastocysts. We identified a window when fibroblast growth factor (FGF) signaling is critical for hypoblast specification. Revisiting FGF signaling in human embryos revealed that inhibition in the early blastocyst suppresses hypoblast formation. In vitro, the induction of hypoblast is synergistically enhanced by limiting trophectoderm and epiblast fates. This finding revises previous reports and establishes a conservation in lineage specification between mice and humans. Overall, this study demonstrates the utility of human naive PSC-based models in elucidating the mechanistic features of early human embryogenesis.

ABSTRACT To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be amenable to standard multiwell-plate manipulations and be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom printed multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen which, in response to the slope of the ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

ABSTRACT T cells are key mediators of the adaptive immune response and show tremendous efficacy as cellular therapeutics. However, obtaining primary T cells from human donors is expensive and variable. Pluripotent stem cells (PSCs) have the potential to serve as a consistent and renewable source of T cells, but differentiating PSCs into hematopoietic progenitors with T cell potential remains a significant challenge. Here, we developed an efficient serum- and feeder-free protocol for differentiating human PSCs into hematopoietic progenitors and T cells. This defined method allowed us to study the impact of individual recombinant proteins on blood emergence and lineage potential. We demonstrate that the presence of DLL4 and VCAM1 during the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) enhances downstream progenitor T cell output by >80-fold. Using single cell transcriptomics, we showed that these two proteins synergise to drive strong notch signalling in nascent hematopoietic stem and progenitor cells and that VCAM1 additionally drives a pro-inflammatory transcriptional program. Finally, we applied this differentiation method to study the impact of cytokine concentration dynamics on T cell maturation. We established optimised media formulations that enabled efficient and chemically defined differentiation of CD8αβ+, CD4-, CD3+, TCRαβ+ T cells from PSCs.