Combination cancer therapies aim to improve the probability and magnitude of therapeutic responses and reduce the likelihood of acquired resistance in an individual patient. However, drugs are tested in clinical trials on genetically diverse patient populations. We show here that patient-to-patient variability and independent drug action are sufficient to explain the superiority of many FDA-approved drug combinations in the absence of drug synergy or additivity. This is also true for combinations tested in patient-derived tumor xenografts. In a combination exhibiting independent drug action, each patient benefits solely from the drug to which his or her tumor is most sensitive, with no added benefit from other drugs. Even when drug combinations exhibit additivity or synergy in pre-clinical models, patient-to-patient variability and low cross-resistance make independent action the dominant mechanism in clinical populations. This insight represents a different way to interpret trial data and a different way to design combination therapies.

5-fluorouracil (5-FU) is a successful and broadly used anti-cancer therapeutic. A major mechanism of action of 5-FU is thought to be through thymidylate synthase (TYMS) inhibition resulting in dTTP depletion and activation of the DNA damage response. This suggests that 5-FU should synergize with other DNA damaging agents. However, we found that combinations of 5-FU and oxaliplatin or irinotecan failed to display any evidence of synergy in clinical trials, and resulted in sub-additive killing in a panel of colorectal cancer (CRC) cell lines. In seeking to understand this antagonism, we unexpectedly found that an RNA damage response during ribosome biogenesis dominates the drug's efficacy in tumor types for which 5-FU shows clinical benefit. 5-FU has an inherent bias for RNA incorporation, and blocking this greatly reduced drug-induced lethality, indicating that accumulation of damaged RNA is more deleterious than the lack of new RNA synthesis. Using 5-FU metabolites that specifically incorporate into either RNA or DNA revealed that CRC cell lines and patient-derived colorectal cancer organoids are inherently more sensitive to RNA damage. This difference held true in cell lines from other tissues in which 5-FU has shown clinical utility, whereas cell lines from tumor tissues that lack clinical 5-FU responsiveness typically showed greater sensitivity to the drug's DNA damage effects. Analysis of changes in the phosphoproteome and ubiquitinome shows RNA damage triggers the selective ubiquitination of multiple ribosomal proteins leading to autophagy-dependent rRNA catabolism and proteasome-dependent degradation of ubiquitinated ribosome proteins. Further, RNA damage response to 5-FU is selectively enhanced by compounds that promote ribosome biogenesis, such as KDM2A inhibitors. These results demonstrate the presence of a strong RNA damage response linked to apoptotic cell death, with clear utility of combinatorially targeting this response in cancer therapy.

Abstract Antibiotic-resistant pathogens are a major public health threat. A deeper understanding of how an antibiotic’s mechanism of action influences the emergence of resistance would aid in the design of new drugs and help to preserve the effectiveness of existing ones. To this end, we developed a model that links bacterial population dynamics with antibiotic-target binding kinetics. Our approach allows us to derive mechanistic insights on drug activity from population-scale experimental data and to quantify the interplay between drug mechanism and resistance selection. We find that whether a drug acts as a bacteriostatic or bactericidal agent has little influence on resistance selection. We also show that heterogeneous drug-target binding within a population enables resistant bacteria to evolve fitness-improving secondary mutations even when drug doses remain above the resistant strain’s minimum inhibitory concentration. Our work suggests that antibiotic doses beyond this “secondary mutation selection window” could safeguard against the emergence of high-fitness resistant strains during treatment.

Abstract Most aggressive lymphomas are treated with combination chemotherapy, commonly as multiple cycles of concurrent drug administration. Concurrent administration is in theory optimal when combination therapies have synergistic (more than additive) drug interactions. We investigated pharmacodynamic interactions in the standard 4-drug ‘CHOP’ regimen in Peripheral T-Cell Lymphoma (PTCL) cell lines, and found that CHOP consistently exhibits antagonism and not synergy. We tested whether staggered treatment schedules could improve tumor cell kill by avoiding antagonism, using month-long in vitro models of concurrent or staggered treatments. Surprisingly, we observed that tumor cell kill is maximized by concurrent drug administration despite antagonistic drug-drug interactions. We propose that an ultrasensitive dose response, as described in radiology by the linear-quadratic (LQ) model, can reconcile these seemingly contradictory experimental observations. The LQ model describes the relationship between cell survival and dose, and in radiology has identified scenarios favoring hypofractionated radiation – the administration of fewer large doses rather than multiple smaller doses. Specifically, hypofractionated treatment can be favored when cells require an accumulation of DNA damage, rather than a ‘single hit’, in order to die. By adapting the LQ model to combination chemotherapy and accounting for tumor heterogeneity, we find that tumor cell kill is maximized by concurrent administration of multiple drugs, even when chemotherapies have antagonistic interactions. Thus, our study identifies a new mechanism by which combination chemotherapy can be clinically beneficial that is not reliant on positive drug-drug interactions.

Abstract Introduction: Heterogeneity between patients and within tumors poses challenges to effective cancer treatment. Drug combinations can overcome heterogeneity by increasing the probability that a patient will have a response to one or more drugs. This approach is successful in numerous disease settings including multiple lymphomas, but technological advances have led to a new approach to addressing heterogeneity: precision approaches that stratify patients into subpopulations with more uniform, stronger responses to specific treatments. These strategies can be implemented together to improve patient outcomes. We have developed computational mechanistic models of cancer treatment in the context of both sources of heterogeneity which explain and predict clinical outcomes of treatment of Large B-cell lymphoma (LBCL) with combination chemoimmunotherapy and CAR T-cell therapy. Combination therapy: Our novel population tumor kinetics (pop-TK) model simulates clinical combination therapy outcomes by implementing multidrug dose response functions in heterogeneous populations of tumor cells, within heterogeneous cohorts of patients. Informed by the outcomes of novel drugs in phase 2 trials in relapsed/refractory (r/r) patients, the pop-TK model accurately predicted of outcomes of seven first-line phase 3 trials of novel combinations. Most notably, informed by treatment of r/r LBCL with polatuzumab-vedotin (pola), the pop-TK predicted the success of modifying the standard treatment regimen (RCHOP) with pola before the clinical trial results were published. The pola combination improves overall survival (OS) and PFS in Activated B-Cell (ABC) LBCL (hazard ratio (HR): OS 0.3, PFS 0.4), but reduces OS (HR: 1.6) and does not improve PFS (HR: 1.0) in Germinal Center B-Cell (GCB) LBCL. The subtype-specific difference in PFS was also predictable based on subtype results of r/r trials (predicted HR: ABC 0.3, GCB 0.9). CAR T-cell therapy: We used a population pharmacokinetic/pharmacodynamic (pop-PK/PD) model of CAR T-cell therapy to reproduce the PFS distribution and the distribution CAR T-cell abundance for CAR T therapy in r/r LBCL patients. The impact of tumor size on patient outcomes in our model and in clinical studies led us to computationally explore the impact of treating smaller tumors with CAR T-cell therapy on treatment outcomes. We found that using detectable circulating tumor DNA (ctDNA) as a biomarker for administering CAR T-cell therapy immediately after RCHOP increased the proportion of simulated patients without a second disease progression event by 30% (HR: 0.43 [0.34, 0.55]). Conclusions: The pop-TK model supports LBCL cell-of-origin subtype as a biomarker for pola performance, and the pop-PK/PD model demonstrates that detectable ctDNA is a potential biomarker for early CAR T-cell administration. These examples of model-driven precision trial design have the potential to improve outcomes using readily available biomarkers and existing therapies. Citation Format: Amy E. Pomeroy, Adam C. Palmer. Mechanistic models of cancer heterogeneity explain and predict clinical outcomes of Large B-Cell Lymphoma (LBCL) treatment [abstract]. In: Proceedings of the Fourth AACR International Meeting on Advances in Malignant Lymphoma: Maximizing the Basic-Translational Interface for Clinical Application; 2024 Jun 19-22; Philadelphia, PA. Philadelphia (PA): AACR; Blood Cancer Discov 2024;5(3_Suppl):Abstract nr PO-005.

Abstract Background. Identifying which patients will benefit from individual therapies remains a general challenge in oncology. Predictive biomarkers of drug sensitivity, when known, can increase the rate of success of trials, and allow stratification of patients for targeted combination therapies, as recent shown by the GUIDANCE-01 trial in Large B-Cell Lymphoma. Peripheral T-Cell Lymphomas (PTCL) could particularly benefit from this approach, being heterogeneous diseases against which many therapies are active in unpredictable subsets of patients. A central challenge of biomarker discovery is finding true determinants of drug response, which may be multiple genes, among thousands of molecular features that may accidentally correlate. Here, we aim to mitigate this challenge by combining functional genetic screens and gene expression profiling in diverse PTCL cultures, to enable the systematic discovery of drug sensitivity biomarkers. Methods. To discover genes whose expression directly modifies drug sensitivity, we conducted genome-wide CRISPR screens with PTCL cells under treatment with five therapies with clinical activity in PTCL: Romidepsin, Pralatrexate, Gemcitabine, Oxaliplatin, and Bortezomib. To discover genes whose basal expression significantly correlates with specific drug sensitivities, we measured RNAseq and drug response functions for a diverse panel of 27 PTCL cultures. Genes in the intersection of both experiments are causally related to and correlate with drug responses in PTCL, and have the statistical benefit of detection by independent methods. Results. Functional genetic screens on therapy provided mechanistic insights for each drug of interest, and identified genes whose perturbation affects drug sensitivity. Whereas hundreds of genes nominally correlate with drug sensitivity in cell line panels, for each drug a shortlist of only 5 to 20 genes are both CRISPR hits and correlate with response across PTCL cultures. For each drug tested, multi-gene sensitivity scores constructed from hits stratify PTCL cultures into statistically distinct sensitive and non-sensitive subgroups (Mann Whitney P-Values <0.01). These genes’ relationships to drug mechanisms were often supported by prior studies, including functions in DNA repair, cell cycle regulation, and solute carriers required for cellular entry of specific therapies, such as SLC19A1 for Pralatrexate and SLC43A2 for Oxaliplatin. Conclusions. Combining functional genetic screens and correlative drug sensitivity measurements narrowed the search for predictive biomarkers of drug sensitivity, and may be a general means of refining biomarker hypotheses for validation in clinical datasets. Although chemotherapy sensitivity is commonly polygenic, multi-gene scores based on few mechanistically-related genes were able to significantly distinguish drug sensitive from resistant PTCLs. These approaches provide novel hypotheses for drug-gene relationships that may serve as the basis for molecular subtyping of individual lymphomas for precision regimens. Citation Format: Adam C Palmer, Jacob C Pantazis. Systematic discovery of chemotherapy response biomarkers in Peripheral T Cell Lymphomas [abstract]. In: Proceedings of the Fourth AACR International Meeting on Advances in Malignant Lymphoma: Maximizing the Basic-Translational Interface for Clinical Application; 2024 Jun 19-22; Philadelphia, PA. Philadelphia (PA): AACR; Blood Cancer Discov 2024;5(3_Suppl):Abstract nr PO-031.

Curative cancer therapies are uncommon and nearly always involve multi-drug combinations developed by experimentation in humans; unfortunately, the mechanistic basis for the success of such combinations has rarely been investigated in detail, obscuring lessons learned. Here we use isobologram analysis to score pharmacological interaction, and clone tracing and CRISPR screening to measure cross-resistance among the five drugs comprising R-CHOP, a combination therapy that frequently cures Diffuse Large B-Cell Lymphomas. We find that drugs in R-CHOP exhibit very low cross-resistance but not synergistic interaction; together they achieve a greater fractional kill according to the null hypothesis for both the Loewe dose-additivity model and the Bliss effect-independence model. These data provide direct evidence for the 50-year old hypothesis that a curative cancer therapy can be constructed on the basis of independently effective drugs having non-overlapping mechanisms of resistance, without synergistic interaction, which has immediate significance for the design of new drug combinations.

Advanced ovarian cancers are a leading cause of cancer-related death in women. Such cancers are currently treated with surgery and chemotherapy which is often temporarily successful but exhibits a high rate of relapse after which treatment options are few. Here we assess the responses of a panel of patient-derived ovarian cancer xenografts (PDXs) to 19 mono and combination therapies, including small molecules and antibody-drug conjugates. The PDX panel aimed to mimic the heterogeneity of disease observed in patients, and exhibited a distribution of responsiveness to standard of care chemotherapy similar to human clinical data. Three monotherapies and one drug combination were found to be active in different subsets of PDXs. By analyzing gene expression data we identified gene expression biomarkers predictive of responsiveness to each of three novel targeted therapy regimens. While no single treatment had as high a response rate as chemotherapy, nearly 90% of PDXs were eligible for and responded to at least one biomarker-guided treatment, including tumors resistant to standard chemotherapy. Biomarker frequency was similar in human patients, suggesting the possibility of a new therapeutic approach to ovarian cancer and demonstrating the potential power of PDX-based trials in broadening the reach of precision cancer medicine.

SUMMARY Individual participant data (IPD) from completed oncology clinical trials are a valuable but rarely available source of information. A lack of minable survival distributions has made it difficult to identify factors determining the success and failure of clinical trials and improve trial design. We imputed survival IPD from ∼500 arms of phase III oncology trials (representing ∼220,000 events) and found that they are well fit by a two-parameter Weibull distribution. This makes it possible to use parametric statistics to substantially increase trial precision with small patient cohorts typical of phase I or II trials. For example, a 50-person trial parameterized using Weibull distributions is as precise as a 90-person trial evaluated using traditional statistics. Mining IPD also showed that frequent violations of the proportional hazards assumption, particularly in trials of immune checkpoint inhibitors (ICIs), arise from time-dependent therapeutic effects and hazard ratios. Thus, the duration of ICI trials has an underappreciated impact on the likelihood of their success.

Frequent mutation of genes in the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in human cancers has stimulated large investments in therapeutic drugs but clinical successes have been rare. As a result, many cancers with high PI3K pathway activity such as triple-negative breast cancer (TNBC) are still treated primarily with conventional chemotherapy. By systematically analyzing responses of TNBC cells to a diverse collection of PI3K pathway inhibitors, we find that one drug, Torin2, is unusually effective because it inhibits both mTOR and PI3K-like kinases (PIKKs). In contrast to mTOR-selective inhibitors, Torin2 exploits dependencies on several kinases for progression of S-phase and for cell cycle checkpoints, thereby causing accumulation of single-stranded DNA and death by replication catastrophe or mitotic failure. Thus, Torin2 and its analogs represent a mechanistically distinct class of PI3K pathway inhibitors that are uniquely cytotoxic to TNBC cells. This insight could be translated therapeutically by further developing Torin2 analogs or combinations of existing mTOR and PIKK inhibitors.