Repurposing FDA-approved inhibitors able to prevent infection by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) could provide a rapid path to establish new therapeutic options to mitigate the effects of coronavirus disease 2019 (COVID-19). Proteolytic cleavages of the spike S protein of SARS-CoV-2, mediated by the host cell proteases cathepsin and TMPRSS2, alone or in combination, are key early activation steps required for efficient infection. The PIKfyve kinase inhibitor apilimod interferes with late endosomal viral traffic, and through an ill-defined mechanism prevents

SARS-CoV-2 cell entry starts with membrane attachment and ends with spike-protein (S) catalyzed membrane fusion depending on two cleavage steps, one usually by furin in producing cells and the second by TMPRSS2 on target cells. Endosomal cathepsins can carry out both. Using real-time 3D single virion tracking, we show fusion and genome penetration requires virion exposure to an acidic milieu of pH 6.2-6.8, even when furin and TMPRSS2 cleavages have occurred. We detect the sequential steps of S1-fragment dissociation, fusion, and content release from the cell surface in TMPRRS2 overexpressing cells only when exposed to acidic pH. We define a key role of an acidic environment for successful infection, found in endosomal compartments and at the surface of TMPRSS2 expressing cells in the acidic milieu of the nasal cavity.Infection by SARS-CoV-2 depends upon the S large spike protein decorating the virions and is responsible for receptor engagement and subsequent fusion of viral and cellular membranes allowing release of virion contents into the cell. Using new single particle imaging tools, to visualize and track the successive steps from virion attachment to fusion, combined with chemical and genetic perturbations of the cells, we provide the first direct evidence for the cellular uptake routes of productive infection in multiple cell types and their dependence on proteolysis of S by cell surface or endosomal proteases. We show that fusion and content release always require the acidic environment from endosomes, preceded by liberation of the S1 fragment which depends on ACE2 receptor engagement.Detailed molecular snapshots of the productive infectious entry pathway of SARS-CoV-2 into cells.

Abstract Mutations in the LRRK2 gene cause familial Parkinson’s disease presenting with pleomorphic neuropathology that can involve α-synuclein or tau accumulation. LRRK2 mutations are thought to converge toward a pathogenic increase in LRRK2 kinase activity. A subset of small Rab GTPases have been identified as LRRK2 substrates, with LRRK2-dependent phosphorylation resulting in Rab inactivation. We used CRISPR/Cas9 genome editing to generate a novel series of isogenic iPSC lines deficient in the two most well validated LRRK2 substrates, Rab8a and Rab10, from two independent, deeply phenotyped healthy control lines. Thorough characterization of NGN2-induced neurons revealed divergent effects of Rab8a and Rab10 deficiency on lysosomal pH, LAMP1 association with Golgi, α-synuclein insolubility and tau phosphorylation, while parallel effects on lysosomal numbers and Golgi clustering were observed. Our data demonstrate largely antagonistic effects of genetic Rab8a or Rab10 inactivation which provide discrete insight into the pathologic features of their biochemical inactivation by pathogenic LRRK2 mutation. Highlights Rab8a and Rab10 deficiency induce lysosomal and Golgi defects Rab8a and Rab10 deficiency induce opposing effects on lysosomal pH Rab8a KO and Rab10 KO neurons show divergent effects on synuclein and tau proteostasis Inactivation of different Rab GTPases can induce distinct disease-relevant phenotypes

The endocytic pathway is both an essential route of molecular uptake in cells and a potential entry point for pathology-inducing cargo. The cell-to-cell spread of cytotoxic aggregates, such as those of α-synuclein (α-syn) in Parkinson's Disease (PD), exemplifies this duality. Here we used a human iPSC-derived induced neuronal model (iNs) prone to death mediated by aggregation in late endosomes and lysosomes of endogenous α-syn, seeded by internalized pre-formed fibrils of α-syn (PFFs). This PFF-mediated death was not observed with parental iPSCs or other non-neuronal cells. Using live-cell optical microscopy to visualize the read out of biosensors reporting endo-lysosome wounding, we discovered that up to about 10% of late endosomes and lysosomes in iNs exhibited spontaneous constitutive perforations, regardless of the presence of internalized PFFs. This wounding, absent in parental iPSCs and non-neuronal cells, corresponded to partial damage by nanopores in the limiting membranes of a subset of endolysosomes directly observed by volumetric focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) in iNs and in CA1 pyramidal neurons from mouse brain, and not found in iPSCs or in other non-neuronal cells in culture or in mouse liver and skin. We suggest that the compromised limiting membranes in iNs and neurons in general are the primary conduit for cytosolic α-syn to access PFFs entrapped within endo-lysosomal lumens, initiating PFF-mediated α-syn aggregation. Significantly, eradicating the intrinsic endolysosomal perforations in iNs by inhibiting the endosomal Phosphatidylinositol-3-Phosphate/Phosphatidylinositol 5-Kinase (PIKfyve kinase) using Apilimod or Vacuolin-1 markedly reduced PFF-induced α-syn aggregation, despite PFFs continuing to enter the endolysosomal compartment. Crucially, this intervention also diminished iN death associated with PFF incubation. Our results reveal the surprising presence of intrinsically perforated endo-lysosomes in neurons, underscoring their crucial early involvement in the genesis of toxic α-syn aggregates induced by internalized PFFs. This discovery offers a basis for employing PIKfyve kinase inhibition as a potential therapeutic strategy to counteract synucleinopathies.