Abstract Cilia are near ubiquitous small, cellular appendages critical for cell-to-cell communication. As such, they are involved in diverse developmental and homeostatic processes, including energy homeostasis. ARL13B is a regulatory GTPase highly enriched in cilia. Mice expressing an engineered ARL13B variant, ARL13B V358A which retains normal biochemical activity, display no detectable ciliary ARL13B. Surprisingly, these mice become obese. Here, we measured body weight, food intake, and blood glucose levels to reveal these mice display hyperphagia and metabolic defects. We showed that ARL13B normally localizes to cilia of neurons in specific brain regions and pancreatic cells but is excluded from these cilia in the Arl13b V358A/V358A model. In addition to its GTPase function, ARL13B acts as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for ARL3. To test whether ARL13B’s GEF activity is required to regulate body weight, we analyzed the body weight of mice expressing ARL13B R79Q , a variant that lacks ARL13B GEF activity for ARL3. We found no difference in body weight. Taken together, our results show that ARL13B functions within cilia to control body weight and that this function does not depend on its role as a GEF for ARL3. Controlling the subcellular localization of ARL13B in the engineered mouse model, ARL13B V358A , enables us to define the cilia-specific role of ARL13B in regulating energy homeostasis.

ABSTRACT The ARF family of regulatory GTPases is ancient, with 16 members predicted to have been present in the last eukaryotic common ancestor. Our phylogenetic profiling of paralogs in diverse species identified four family members whose presence correlates with that of a cilium/flagellum: ARL3, ARL6, ARL13, and ARL16. No prior evidence links ARL16 to cilia or other cell functions, despite its presence throughout eukaryotes. Deletion of ARL16 in MEFs results in decreased ciliogenesis yet increased ciliary length. We also found Arl16 KO in MEFs to alter ciliary protein content, including loss of ARL13B, ARL3, INPP5E, and the IFT-A core component IFT140. Instead, both INPP5E and IFT140 accumulate at the Golgi in Arl16 KO lines, while other IFT proteins do not, suggesting a specific defect in traffic from Golgi to cilia. We propose that ARL16 regulates a Golgi-cilia traffic pathway and is required specifically in the export of IFT140 and INPP5E from the Golgi. Summary Phylogenetic analyses of ARF family GTPases predict that ARL16 is linked to cilia. This was confirmed using MEFs deleted for ARL16, resulting in defects in Golgi to cilium traffic, with accumulation of IFT140 and INPP5E at Golgi.

ABSTRACT ELMODs are a family of three mammalian paralogs that display GTPase activating protein (GAP) activity towards a uniquely broad array of ADP-ribosylation factor (ARF) family GTPases that includes ARF-like (ARL) proteins. ELMODs are ubiquitously expressed in mammalian tissues, highly conserved across eukaryotes, and ancient in origin, being present in the last eukaryotic common ancestor. We described functions of ELMOD2 in immortalized mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in the regulation of cell division, microtubules, ciliogenesis, and mitochondrial fusion. Here, using similar strategies with the paralogs ELMOD1 and ELMOD3, we identify novel functions and locations of these cell regulators and compare them to those of ELMOD2, allowing determination of functional redundancy among the family members. We found strong similarities in phenotypes resulting from deletion of either Elmod1 or Elmod3 and marked differences from those arising in Elmod2 deletion lines. Deletion of either Elmod1 or Elmod3 results in the decreased ability of cells to form primary cilia, loss of a subset of proteins from cilia, and accumulation of some ciliary proteins at the Golgi, predicted to result from compromised traffic from the Golgi to cilia. These phenotypes are reversed upon expression of activating mutants of either ARL3 or ARL16, linking their roles to ELMOD1/3 actions. Thus, we believe that ELMOD1 and ELMOD3 perform multiple functions in cells, most prominently linked to ciliary biology and Golgi-ciliary traffic, and likely acting from more than one cellular location.

Abstract ADP-ribosylation factor-like protein 13B (ARL13B), a regulatory GTPase and guanine exchange factor (GEF) enriches in primary cilia and promotes tumorigenesis in part by regulating Smoothened (SMO), GLI, and Sonic hedgehog (SHH) signaling. Gliomas with increased ARL13B, SMO and GLI2 expression are more aggressive but the relationship to cilia is unclear. Previous studies showed increasing ARL13B in glioblastoma cells promoted ciliary SMO accumulation, independent of exogenous SHH addition. Here we show SMO accumulation is due to increased ciliary, but not extraciliary ARL13B. Increasing ARL13B expression promotes the accumulation of both activated SMO and GLI2 in glioma cilia, but not in NIH3T3 fibroblast cilia. ARL13B-driven increases in ciliary SMO and GLI2 are resistant to SMO inhibitors, GDC-0449 and cyclopamine. Finally, temozolomide chemotherapy which increases ARL13B expression in glioma, stimulates SMO and GLI2 into glioma cilia, but not fibroblast cilia. Collectively, our data suggest factors that elevate ARL13B may drive drug-resistant SMO and GLI into cilia. This suggests the ARL13B-associated mechanism that leads to ciliary SMO/GLI recruitment may promote treatment resistance in glioma.

Sonic hedgehog (Shh) signal transduction specifies ventral cell fates in the neural tube and is mediated by the Gli transcription factors that play both activator (GliA) and repressor (GliR) roles. Cilia are essential for Shh signal transduction and the ciliary phosphatidylinositol phosphatase, Inpp5e, is linked to Shh regulation. In the course of a forward genetic screen for recessive mouse mutants, we identified a functional null allele of Inpp5e, ridge top (rdg), with expanded ventral neural cell fates at E10.5. By E12.5, Inpp5erdg/rdg embryos displayed normal neural patterning and this correction over time required Gli3, the predominant repressor in neural patterning. Inpp5erdg function largely depended on the presence of cilia and on Smoothened, the obligate transducer of Shh signaling, indicating Inpp5e functions within the cilium to regulate the pathway. These data indicate that Inpp5e plays a more complicated role in Shh signaling than previously appreciated. We propose that Inpp5e attenuates Shh signaling in the neural tube through regulation of the relative timing of GliA and GliR production, which is important in understanding how duration of Shh signaling regulates neural tube patterning.

SUMMARY The 1.6 Mb 3q29 deletion is associated with developmental and psychiatric phenotypes. Reduced birthweight and a high prevalence of feeding disorders in patients suggest underlying metabolic dysregulation. We investigated 3q29 deletion-induced metabolic changes using the B6.Del16 +/ Bdh1-Tfrc mouse model. We found that B6.Del16 +/ Bdh1-Tfrc animals preferentially use dietary lipids as an energy source. Untargeted metabolomics showed a strong sex-dependent effect of the 3q29 deletion on fat metabolism. A high-fat diet (HFD) partially rescued the 3q29 deletion-associated weight deficit in females, but not males. Untargeted metabolomics after HFD revealed persistent fat metabolism alterations in females. The HFD did not affect B6.Del16 +/ Bdh1-Tfrc behavioral phenotypes, suggesting that 3q29 deletion-associated metabolic and behavioral outcomes are uncoupled. Our data indicate a HFD intervention in 3q29 deletion syndrome may improve weight phenotypes without exacerbating behavioral manifestations. Our study also highlights the importance of assessing sex in metabolic studies and suggests mechanisms underlying 3q29 deletion-associated metabolic phenotypes are sex-specific.

Abstract ELMOD2 is a GTPase activating protein (GAP) with uniquely broad specificity for ARF family GTPases. We previously showed that it acts with ARL2 in mitochondrial fusion and microtubule stability and with ARF6 during cytokinesis. Mouse embryonic fibroblasts deleted for ELMOD2 also displayed changes in cilia related processes including increased ciliation, multiciliation, ciliary morphology, ciliary signaling, centrin accumulation inside cilia, and loss of rootlets at centrosomes with loss of centrosome cohesion. Increasing ARL2 activity or overexpressing Rootletin reversed these defects, revealing close functional links between the three proteins. This was further supported by the findings that deletion of Rootletin yielded similar phenotypes, which were rescued upon increasing ARL2 activity but not ELMOD2 overexpression. Thus, we propose that ARL2, ELMOD2, and Rootletin all act in a common pathway that suppresses spurious ciliation and maintains centrosome cohesion. Screening a number of markers of steps in the ciliation pathway support a model in which ELMOD2, Rootletin, and ARL2 act downstream of TTBK2 and upstream of CP110 to prevent spurious release of CP110 and to regulate ciliary vesicle docking. These data thus provide evidence supporting roles for ELMOD2, Rootletin, and ARL2 in the regulation of ciliary licensing.

ABSTRACT During Hedgehog (Hh) signal transduction in development and disease, the atypical G protein-coupled receptor (GPCR) SMOOTHENED (SMO) communicates with GLI transcription factors by binding the protein kinase A catalytic subunit (PKA-C) and physically blocking its enzymatic activity. Here we show that GPCR kinase 2 (GRK2) orchestrates this process during endogenous Hh pathway activation in the primary cilium. Upon SMO activation, GRK2 rapidly relocalizes from the ciliary base to the shaft, triggering SMO phosphorylation and PKA-C interaction. Reconstitution studies reveal that GRK2 phosphorylation enables active SMO to bind PKA-C directly. Lastly, the SMO-GRK2-PKA pathway underlies Hh signal transduction in a range of cellular and in vivo models. Thus, GRK2 phosphorylation of ciliary SMO, and the ensuing PKA-C binding and inactivation, are critical initiating events for the intracellular steps in Hh signaling. More broadly, our study suggests an expanded role for GRKs in enabling direct GPCR interactions with diverse intracellular effectors.

Abstract Patients with the ciliopathy Joubert syndrome present with physical anomalies, intellectual disability, and a hindbrain malformation described as the “molar tooth sign” due to its appearance on an MRI. This radiological abnormality results from a combination of hypoplasia of the cerebellar vermis and inappropriate targeting of the white matter tracts of the superior cerebellar peduncles. ARL13B is a cilia-enriched regulatory GTPase established to regulate cell fate, cell proliferation and axon guidance through vertebrate Hedgehog signaling. In patients, mutations in ARL13B cause Joubert syndrome. In order to understand the etiology of the molar tooth sign, we used mouse models to investigate the role of ARL13B during cerebellar development. We found ARL13B regulates superior cerebellar peduncle targeting and these fiber tracts require Hedgehog signaling for proper guidance. However, in mouse the Joubert-causing R79Q mutation in ARL13B does not disrupt Hedgehog signaling nor does it impact tract targeting. We found a small cerebellar vermis in mice lacking ARL13B function but no cerebellar vermis hypoplasia in mice expressing the Joubert-causing R79Q mutation. Additionally, mice expressing a cilia-excluded variant of ARL13B that transduces Hedgehog normally, showed normal tract targeting and vermis width. Taken together, our data indicate that ARL13B is critical for control of cerebellar vermis width as well as superior cerebellar peduncle axon guidance, likely via Hedgehog signaling. Thus, our work highlights the complexity of ARL13B in molar tooth sign etiology. Summary statement Joubert syndrome is diagnosed by the hindbrain “molar tooth sign” malformation. Using mouse models, we show loss of the ciliary GTPase ARL13B, mutations in which lead to Joubert syndrome, result in two features of the molar tooth sign: hypoplasia of the cerebellar vermis and inappropriate targeting of the superior cerebellar peduncles. Furthermore, we demonstrate that loss of vertebrate Hedgehog signaling may be the underlying disrupted mechanism as we extend its role in axon guidance to the superior cerebellar peduncles.

ARL13B is a regulatory GTPase highly enriched in cilia. Complete loss of Arl13b disrupts cilia architecture, protein trafficking and Sonic hedgehog signaling. To determine whether ARL13B is required within cilia, we knocked in a cilia-excluded variant of ARL13B (V358A) and showed it retains all known biochemical function. We found that ARL13BV358A protein was expressed but could not be detected in cilia, even when retrograde ciliary transport was blocked. We showed Arl13bV358A/V358A mice are viable and fertile with normal Shh signal transduction. However, in contrast to wild type cilia, Arl13bV358A/V358A cells displayed short cilia and lacked ciliary ARL3 and INPP5E. These data indicate that ARL13B’s role within cilia can be uncoupled from its function outside of cilia. Furthermore, these data imply that the cilia defects upon complete absence of ARL13B do not underlie the alterations in Shh transduction, which is unexpected given the requirement of cilia for Shh transduction.