The spread of retroviruses between cells is estimated to be 2-3 orders of magnitude more efficient when cells can physically interact with each other. The underlying mechanism is largely unknown, but transfer is believed to occur through large-surface interfaces, called virological or infectious synapses. Here, we report the direct visualization of cell-to-cell transmission of retroviruses in living cells. Our results reveal a mechanism of virus transport from infected to non-infected cells, involving thin filopodial bridges. These filopodia originate from non-infected cells and interact, through their tips, with infected cells. A strong association of the viral envelope glycoprotein (Env) in an infected cell with the receptor molecules in a target cell generates a stable bridge. Viruses then move along the outer surface of the filopodial bridge toward the target cell. Our data suggest that retroviruses spread by exploiting an inherent ability of filopodia to transport ligands from cell to cell.

Retroviral assembly and budding is driven by the Gag polyprotein and requires the host‐derived vacuolar protein sorting (vps) machinery. With the exception of human immunodeficiency virus (HIV)‐infected macrophages, current models predict that the vps machinery is recruited by Gag to viral budding sites at the cell surface. However, here we demonstrate that HIV Gag and murine leukemia virus (MLV) Gag also drive assembly intracellularly in cell types including 293 and HeLa cells, previously believed to exclusively support budding from the plasma membrane. Using live confocal microscopy in conjunction with electron microscopy of cells generating fluorescently labeled virions or virus‐like particles, we observed that these retroviruses utilize late endosomal membranes/multivesicular bodies as assembly sites, implying an endosome‐based pathway for viral egress. These data suggest that retroviruses can interact with the vps sorting machinery in a more traditional sense, directly linked to the mechanism by which cellular proteins are sorted into multivesicular endosomes.

Viruses have often been observed in association with the dense microvilli of polarized epithelia as well as the filopodia of nonpolarized cells, yet whether interactions with these structures contribute to infection has remained unknown. Here we show that virus binding to filopodia induces a rapid and highly ordered lateral movement, "surfing" toward the cell body before cell entry. Virus cell surfing along filopodia is mediated by the underlying actin cytoskeleton and depends on functional myosin II. Any disruption of virus cell surfing significantly reduces viral infection. Our results reveal another example of viruses hijacking host machineries for efficient infection by using the inherent ability of filopodia to transport ligands to the cell body.

Abstract Super-resolution microscopy has become an indispensable tool across diverse research fields, offering unprecedented insights into biological architectures with nanometer scale resolution. Compared to traditional nanometer-scale imaging methods such as electron microscopy, super-resolution microscopy offers several advantages, including the simultaneous labeling of multiple target biomolecules with high specificity and simpler sample preparation, making it accessible to most researchers. In this study, we introduce two optimized methods of super-resolution imaging: 4-fold and 12-fold 3D-isotropic and preserved Expansion Microscopy (4x and 12x 3D-ExM). 3D-ExM is a straightforward expansion microscopy method featuring a single-step process, providing robust and reproducible 3D isotropic expansion for both 2D and 3D cell culture models. With standard confocal microscopy, 12x 3D-ExM achieves a lateral resolution of under 30 nm, enabling the visualization of nanoscale structures, including chromosomes, kinetochores, nuclear pore complexes, and Epstein-Barr virus particles. These results demonstrate that 3D-ExM provides cost-effective and user-friendly super-resolution microscopy, making it highly suitable for a wide range of cell biology research, including studies on cellular and chromatin architectures.

HIV-1 RNA genomes interact with diverse RNA binding proteins in the cytoplasm including antiviral factor APOBEC3G (A3G) that, in the absence of viral Vif proteins, is packaged into virions. When and where genome-A3G interactions are initiated in the host cell is unknown. Here we use quantitative long-term (>24 h) live cell fluorescence video microscopy and a new in-cell RNA-protein interaction assay (the "IC-IP") to describe subcellular viral and A3G trafficking behaviors over the entire HIV-1 productive phase. Among other findings, we demonstrate that genome-A3G interactions are initiated in the cytosol soon if not immediately after genome nuclear export; that A3G-genome interactions are sufficiently strong so that tethering either factor to membranes inhibits trafficking of the reciprocal binding partner; and that selective recognition of genomes promotes consistent delivery of A3G to sites of virion assembly. Further elucidation of RNA signature(s) detected by A3G may inform development of RNA-targeted antivirals.

ABSTRACT HIV-1 generates unspliced (US), partially spliced (PS), and completely spliced (CS) classes of RNAs; each playing distinct roles in viral replication. Elucidating their host protein “interactomes” is crucial to understanding virus-host interplay. Here, we present HyPR-MS SV for isolation of US, PS, and CS transcripts from a single population of infected CD4+ T-cells and mass spectrometric identification of their in vivo protein interactomes. Analysis revealed 212 proteins differentially associated with the unique RNA classes; including, preferential association of regulators of RNA stability with US- and PS-transcripts and, unexpectedly, mitochondria-linked proteins with US-transcripts. Remarkably, >80 of these factors screened by siRNA knock-down impacted HIV-1 gene expression. Fluorescence microscopy confirmed several to co-localize with HIV-1 US RNA and exhibit changes in abundance and/or localization over the course of infection. This study validates HyPR-MS SV for discovery of viral splice variant protein interactomes and provides an unprecedented resource of factors and pathways likely important to HIV-1 replication.

Abstract HIV-1 virion production is inefficient in cells derived from mice and other rodents reflecting cell-intrinsic defects to interactions between the HIV-1 auxiliary proteins Tat and Rev and host dependency factors CCNT1 (Cyclin T1) and XPO1 (Exportin-1, also known as CRM1), respectively. In human cells, Tat binds CCNT1 to enhance viral RNA transcription and Rev recruits XPO1 to mediate the nuclear export of intron-containing viral RNA. In mouse cells, Tat’s interactions with CCNT1 are inefficient, mapped to a single species-specific residue Y261 instead of C261 in human. Rev interacts poorly with murine XPO1, mapped to a trio of amino acids T411/V412/S414 instead of P411/M412/F414 in humans. To determine if these discrete species-specific regions of otherwise conserved housekeeping proteins represent viable targets for inhibiting Tat and Rev function in humans, herein we recoded (“mousified”) each in human CD4+ T cells using precision CRISPR/Cas9-facilitated gene editing. Both edits yielded cells refractory to Rev or Tat activity, respectively, with isolated, isogenic CCNT1.C261Y cell lines remarkable in their capacity to exhibit near total inactivation of viral gene expression for all X4 and R5-tropic HIV-1 strains tested, and even the more distantly related lentiviruses including HIV-2 and SIV agm . These studies validate minor and naturally-occurring, species-specific differences in otherwise conserved human host factors as compelling targets for achieving broad-acting cell-intrinsic resistance to HIV’s post-integration phases. Importance Unlike humans, mice are unable to support HIV-1 infection. This is due, in part, to a constellation of defined minor, species-specific differences in conserved host proteins needed for viral gene expression. Here, we used precision CRISPR/Cas9 editing to engineer “mousified” versions of two of these proteins, CCNT1 and XPO1, in human T cells. CCNT1 and XPO1 are essential for efficient HIV-1 transcription and viral RNA transport, respectively, making them intriguing targets for gene-based inactivation of virus replication. Targeting either gene yielded antiviral phenotypes, with isogenic CCNT1-modified cell lines confirmed to exhibit potent, durable, and broad-spectrum resistance to HIV-1 and other pathogenic lentiviruses, and with no discernible impact on host cells. These results provide proof of concept for targeting CCNT1 (and potentially XPO1) in the context of one or more functional HIV-1 cure strategies.

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Virion Infectivity Factor (Vif) targets and degrades cellular APOBEC3 proteins, key regulators of intrinsic and innate antiretroviral immune responses, thereby facilitating HIV-1 infection. While Vif's role in degrading APOBEC3G is well-studied, Vif is also known to cause cell cycle arrest but the detailed nature of Vif's effects on the cell cycle has yet to be delineated. In this study, we employed high-temporal single-cell live imaging and super-resolution microscopy to monitor individual cells during Vif-induced cell cycle arrest. Our findings reveal that Vif does not affect the G2/M boundary as previously thought. Instead, Vif triggers a unique and robust pseudo-metaphase arrest, which is markedly distinct from the mild prometaphase arrest induced by the HIV-1 accessory protein, Vpr, known for modulating the cell cycle. During Vif-mediated arrest, chromosomes align properly to form a metaphase plate but later disassemble, resulting in polar chromosomes. Notably, unlike Vpr, Vif significantly reduces the levels of both Phosphatase 1 (PP1) and 2 (PP2) at kinetochores, which are key regulators of chromosome-microtubule interactions. These results reveal a novel function of Vif in kinetochore regulation that governs the spatial organization of chromosomes during mitosis.

The spatial distribution of messenger RNAs (mRNAs) within the cytoplasm can be a crucial determinant of gene expression. Here we provide evidence that a devastating viral pathogen, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), exploits localized translation to favor the formation of infectious, transmissible virions at the surface of infected cells. Artificially tethering viral mRNAs encoding the Gag and Gag-Pol capsid proteins (gag-pol mRNAs) to alternative regions of the cell such as cytoplasmic vesicles or the actin cytoskeletion markedly alters Gag subcellular distribution, perturbs sites of assembly, and reduces virus particle production. These and additional findings suggest a model for HIV-1 assembly wherein localized Gag/Gag-Pol translation coupled to confined interactions between Gag and viral genomes ensures infectious virion production at the right place and the right time. Perturbing HIV-1 mRNA subcellular localization could represent a novel antiviral strategy.

Dendritic cell (DC) lectins mediate the recognition, uptake, and processing of antigens, but they can also be co-opted by pathogens for infection. These distinct activities depend upon the routing of antigens within the cell. Antigens directed to endosomal compartments are degraded and the peptides presented on MHC class II molecules thereby promoting immunity. Alternatively, HIV-1 can avoid degradation, as virus engagement with C-type lectin receptors (CLRs), such as DC-SIGN, results in trafficking to surface-accessible invaginated pockets. This process appears to enable infection of T cells in trans. We sought to explore whether antigen fate upon CLR-mediated internalization was affected by antigen physical properties. To this end, we employed the ring-opening metathesis polymerization to generate glycopolymers that each display multiple copies of mannoside ligand for DC-SIGN yet differ in length and size. The rate and extent of glycopolymer internalization depended upon polymer structure-longer polymers were internalized more rapidly and more efficiently than were shorter polymers. The trafficking, however, did not differ, and both short and longer polymers colocalized with transferrin-labeled early endosomes. To explore how DC-SIGN directs larger particles, such as pathogens, we induced aggregation of the polymers to access particulate antigens. Strikingly, these particulate antigens were diverted to the invaginated pockets that harbor HIV-1. Thus, antigen structure has a dramatic effect on DC-SIGN-mediated uptake and trafficking. These findings have consequences for the design of synthetic vaccines. Additionally, the results suggest new strategies for targeting DC reservoirs that harbor viral pathogens.