A bstract X-ray crystallography is an invaluable technique for studying the atomic structure of macromolecules. Much of crystallography’s success is due to the software packages developed to enable the automated processing of diffraction data. However, the analysis of unconventional diffraction experiments can still pose significant challenges—many existing programs are closed-source, sparsely documented, or are challenging to integrate with modern libraries for scientific computing and machine learning. Here we describe reciprocalspaceship , a Python library for exploring reciprocal space. It provides a tabular representation for reflection data from diffraction experiments that extends the widely-used pandas library with built-in methods for handling space group, unit cell, and symmetry-based operations. As we illustrate, this library facilitates new modes of exploratory data analysis while supporting the prototyping, development, and release of new methods.

Enzymes catalyze biochemical reactions through precise positioning of substrates, cofactors, and amino acids to modulate the transition-state free energy. However, the role of conformational dynamics remains poorly understood due to lack of experimental access. This shortcoming is evident with E. coli dihydrofolate reductase (DHFR), a model system for the role of protein dynamics in catalysis, for which it is unknown how the enzyme regulates the different active site environments required to facilitate proton and hydride transfer. Here, we present ligand-, temperature-, and electric-field-based perturbations during X-ray diffraction experiments that enable identification of coupled conformational changes in DHFR. We identify a global hinge motion and local networks of structural rearrangements that are engaged by substrate protonation to regulate solvent access and promote efficient catalysis. The resulting mechanism shows that DHFR's two-step catalytic mechanism is guided by a dynamic free energy landscape responsive to the state of the substrate.

A bstract Novel X-ray methods are transforming the study of the functional dynamics of biomolecules. Key to this revolution is detection of often subtle conformational changes from diffraction data. Diffraction data contain patterns of bright spots known as reflections. To compute the electron density of a molecule, the intensity of each reflection must be estimated, and redundant observations reduced to consensus intensities. Systematic effects, however, lead to the measurement of equivalent reflections on different scales, corrupting observation of changes in electron density. Here, we present a modern Bayesian solution to this problem, which uses deep learning and variational inference to simultaneously rescale and merge reflection observations. We successfully apply this method to monochromatic and polychromatic single-crystal diffraction data, as well as serial femtosecond crystallography data. We find that this approach is applicable to the analysis of many types of diffraction experiments, while accurately and sensitively detecting subtle dynamics and anomalous scattering.

Abstract Chemical and conformational changes underlie the functional cycles of proteins. Comparative crystallography can reveal these changes over time, over ligands, and over chemical and physical perturbations in atomic detail. A key difficulty, however, is that the resulting observations must be placed on the same scale by correcting for experimental factors. We recently introduced a Bayesian framework for correcting (scaling) X-ray diffraction data by combining deep learning with statistical priors informed by crystallographic theory. To scale comparative crystallography data, we here combine this framework with a multivariate statistical theory of comparative crystallography. By doing so, we find strong improvements in the detection of protein dynamics, element-specific anomalous signal, and the binding of drug fragments.

A bstract Single-wavelength anomalous diffraction (SAD) is a routine method for overcoming the phase problem when solving a new macromolecular structure. This technique requires the accurate measurement of intensities to sensitively determine differences across Bijvoet pairs, making it a stringent test for the reliability of a data collection method. Although SAD experiments are commonly conducted at cryogenic temperatures to mitigate the effects of radiation damage, such temperatures can alter the conformational ensemble of the protein crystal and may impede the merging of data from multiple crystals due to non-uniform freezing. Here, we propose a data collection strategy to obtain high-quality data from room temperature samples. To illustrate the strengths of this approach we use native SAD phasing at 6.5 keV to solve four structures of three model systems at 295 K. The resulting datasets allow for automatic phasing and model building, and exhibit alternate conformations that are well-supported by the electron density. The high-redundancy data collection method demonstrated here enables the routine collection of high-quality, room-temperature diffraction to improve the study of protein conformational ensembles.

DJ-1 (PARK7) is an intensively studied protein whose cytoprotective activities are dysregulated in multiple diseases. DJ-1 has been reported as having two distinct enzymatic activities in defense against reactive carbonyl species that are difficult to distinguish in conventional biochemical experiments. Here, we establish the mechanism of DJ-1 using a synchrotron-compatible version of mix-and-inject-serial crystallography (MISC), which was previously performed only at XFELs, to directly observe DJ-1 catalysis. We designed and used new diffusive mixers to collect time-resolved Laue diffraction data of DJ-1 catalysis at a pink beam synchrotron beamline. Analysis of structurally similar methylglyoxal-derived intermediates formed through the DJ-1 catalytic cycle shows that the enzyme catalyzes nearly two turnovers in the crystal and defines key aspects of its glyoxalase mechanism. In addition, DJ-1 shows allosteric communication between a distal site at the dimer interface and the active site that changes during catalysis. Our results rule out the widely cited deglycase mechanism for DJ-1 action and provide an explanation for how DJ-1 produces L-lactate with high chiral purity.

Most X-ray sources are inherently polychromatic. Polychromatic (“pink”) X-rays provide an efficient way to conduct diffraction experiments as many more photons can be used and large regions of reciprocal space can be probed without sample rotation during exposure—ideal conditions for time-resolved applications. Analysis of such data is complicated, however, causing most X-ray facilities to discard > 99% of X-ray photons to obtain monochromatic data. Key challenges in analyzing polychromatic diffraction data include lattice searching, indexing and wavelength assignment, correction of measured intensities for wavelength-dependent effects, and deconvolution of harmonics. We recently described an algorithm, Careless, that can perform harmonic deconvolution and correct measured intensities for variation in wavelength when presented with integrated diffraction intensities and assigned wavelengths. Here, we present Laue-DIALS, an open-source software pipeline that indexes and integrates polychromatic diffraction data. Laue-DIALS is based on the dxtbx toolbox, which supports the DIALS software commonly used to process monochromatic data. As such, Laue-DIALS provides many of the same advantages: an open-source, modular, and extensible architecture, providing a robust basis for future development. We present benchmark results showing that Laue-DIALS, together with Careless, provides a suitable approach to the analysis of polychromatic diffraction data, including for time-resolved applications.

Time-resolved X-ray crystallography (TR-X) at synchrotrons and free electron lasers is a promising technique for recording dynamics of molecules at atomic resolution. While experimental methods for TR-X have proliferated and matured, data analysis is often difficult. Extracting small, time-dependent changes in signal is frequently a bottleneck for practitioners. Recent work demonstrated this challenge can be addressed when merging redundant observations by a statistical technique known as variational inference (VI). However, the variational approach to time-resolved data analysis requires identification of successful hyperparameters in order to optimally extract signal. In this case study, we present a successful application of VI to time-resolved changes in an enzyme, DJ-1, upon mixing with a substrate molecule, methylglyoxal. We present a strategy to extract high signal-to-noise changes in electron density from these data. Furthermore, we conduct an ablation study, in which we systematically remove one hyperparameter at a time to demonstrate the impact of each hyperparameter choice on the success of our model. We expect this case study will serve as a practical example for how others may deploy VI in order to analyze their time-resolved diffraction data.

Site-specific labeling of proteins is often a prerequisite for biophysical and biochemical characterization. Chemical modification of a unique cysteine residue is among the most facile methods for site-specific labeling of proteins. However, many proteins have multiple reactive cysteines, which must be mutated to other residues to enable labeling of unique positions. This trial-and-error process often results in cysteine-free proteins with reduced activity or stability. Herein we describe a general methodology to rationally engineer cysteine-less proteins. Briefly, natural variation across orthologues is exploited to identify suitable cysteine replacements compatible with protein activity and stability. As a proof-of-concept, we recount the successful engineering of a cysteine-less mutant of the group II chaperonin from methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis. A webapp, REP-X (Replacement at Endogenous Positions from eXtant sequences), which enables users to design their own cysteine-less protein variants, will make this rational approach widely available.