The DNA sequence, d(AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG), occurs within the promoter region of the c-kit oncogene. We show here, using a combination of NMR, circular dichroism, and melting temperature measurements, that this sequence forms a four-stranded quadruplex structure under physiological conditions. Variations in the sequences that intervene between the guanine tracts have been examined, and surprisingly, none of these modified sequences forms a quadruplex arrangement under these conditions. This suggests that the occurrence of quadruplex-forming sequences within the human and other genomes is less than was hitherto expected. The c-kit quadruplex may be a new target for therapeutic intervention in cancers where there is elevated expression of the c-kit gene.

To rationalise the binding of specific ligands to RNA-quadruplex we investigated several naphthalene diimide ligands that interact with the non-coding region of Pseudorabies virus (PRV). Herein we report on the x-ray structure of the naphthalene diimide ND11 with an RNA G-quadruplex putative forming sequence from rPRV. Consistent with previously observed rPRV sequence it assembles into a bimolecular RNA G-quadruplex consisting of a pair of two tetrads stacked 3ʹ to 5ʹ. We observe that ND11 interacts by binding on both the externally available 5ʹ and 3ʹ quartets. The CUC (loop 1) is structurally altered to enhance the 5ʹ mode of interaction. These loop residues are shifted significantly to generate a new ligand binding pocket whereas the terminal A14 residue is lifted away from the RNA G-quadruplex tetrad plane to be restacked above the bound ND11 ligand NDI core. CD analysis of this family of NDI ligands shows consistency in the spectra between the different ligands in the presence of the rPRV RNA G-quadruplex motif, reflecting a common folded topology and mode of ligand interaction. FRET melt assay confirms the strong stabilising properties of the tetrasubstituted NDI compounds and the contributions length of the substituted groups have on melt temperatures.

ABSTRACT The insulin linked polymorphic region (ILPR) is a variable number of tandem repeats (VNTR) region of DNA in the promoter of the insulin gene that regulates transcription of insulin. This region is known to form the alternative DNA structures, i-motifs and G-quadruplexes. Individuals have different sequence variants of VNTR repeats and although previous work investigated the effects of some variants on G-quadruplex formation, there is not a clear picture of the relationship between the sequence diversity, the DNA structures formed, and the functional effects on insulin gene expression. Here we show that different sequence variants of the ILPR form different DNA secondary structures and insulin expression is dependent on formation of i-motif and G-quadruplex structures. The first crystal structure and dynamics of an intramolecular i-motif also reveal sequences within the loop regions forming additional stabilising interactions, which are critical to formation of the stable i-motif structures that modulate insulin expression. The outcomes of this work reveal the detail in formation of stable i-motif DNA structures, with potential for rational based drug design for compounds to alter insulin gene expression.

ABSTRACT The design of RNA-targeting antivirals offers a potent means in controlling viral infections. An essential prerequisite to this design depends on identifying functional RNA structures in the viral genome, as well as those that are readily accessible to drugs in cells. Techniques that probe RNA structures in situ have been developed recently including SHAPE-MaP. In this study, we report on the application of SHAPE-MaP to the Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) RNA genome to categorize RNAs that are well folded, dynamic, or in the single strands by the combination of two parameters, SHAPE reactivity and Shannon entropy. Dynamic RNAs have the potential to fold into specific structures, and stabilizing their structures with compounds could be a new idea for drug design, which is demonstrated by the example of the G-quadruplex forming sequence. siRNAs targeting stable single-stranded RNA regions presented higher antiviral success rates. Our results show that the RNAs in the single strands could be efficient antiviral targets, and that SHAPE-MaP is an effective method to identify targetable structures in the viral RNA genomes through analysis of folding features. GRAPHICAL ABSTRACT