ABSTRACT CRISPR-Cas systems provide their prokaryotic hosts with sequence-specific immunity to foreign genetic elements, including bacteriophages and plasmids. While most interfere with phage infection though cleavage of viral DNA, type VI CRISPR systems use the RNA-guided nuclease Cas13 to recognize mRNA targets. Upon engaging with target RNA, Cas13 cleaves both phage and host transcripts nonspecifically, leading to a state of cell dormancy that is incompatible with phage propagation. However, whether and how infected cells recover from dormancy is not clear. Here we show that type VI CRISPR systems frequently co-occur with DNA-cleaving restriction modification (RM) systems. Using genetics and microscopy, we show that Cas13 and RM systems synergize in anti-phage defense in the natural type VI CRISPR host Listeria seeligeri . Cleavage of the phage genome by RM removes the source of phage transcripts, enabling cells to recover from Cas13-induced cellular dormancy. We find that Cas13 and RM systems operating simultaneously eliminate phage DNA and neutralize infection more effectively than either defense alone. Thus, cells harboring both defense systems exhibit robust anti-phage immunity and survive infection. Our work therefore reveals that type VI CRISPR immunity is cell-autonomous and non-abortive, if paired with RM or similar DNA-targeting defenses. The ability of an abortive response to be resolved by the actions of another anti-phage defense has implications for the roles of diverse host-directed immune systems in bacteria.

ABSTRACT Prokaryotic CRISPR-Cas immunity is subverted via anti-CRISPRs (Acrs), small proteins that inhibit Cas protein activities when expressed during the phage lytic cycle or from resident prophages or plasmids. CRISPR-Cas defenses are classified into 6 types and 33 subtypes, which employ a diverse suite of Cas effectors and differ in their mechanisms of interference. As Acrs often work via binding to a cognate Cas protein, inhibition is almost always limited to a single CRISPR type. Furthermore, while acr genes are frequently organized together in phage-associated gene clusters, how such inhibitors initially evolve has remained unclear. Here we have investigated the Acr content and inhibition specificity of a collection of Listeria isolates, which naturally harbor four diverse CRISPR-Cas systems (types I-B, II-A, II-C, and VI-A). We observed widespread antagonism of CRISPR, which we traced to 12 novel and 4 known Acr gene families encoded on endogenous mobile genetic elements. Among these were two Acrs that possess sequence homology to type I-B Cas proteins and assemble into a defective interference complex. Surprisingly, an additional type I-B Cas homolog did not affect type I immunity, but instead inhibited the RNA-targeting type VI CRISPR system through sequestration of crRNA. By probing the IMGVR database of viral genomes, we detected abundant orphan cas genes located within putative anti-defense gene clusters. We experimentally verified the Acr activity of one viral cas gene, a particularly broad-spectrum cas3 homolog that inhibits type I-B, II-A, and VI-A CRISPR immunity. Our observations provide direct evidence of Acr evolution via cas gene co-option, and new genes with potential for broad-spectrum control of genome editing technologies.