Defects in nuclear morphology often correlate with the onset of disease, including cancer, progeria, cardiomyopathy, and muscular dystrophy. However, the mechanism by which a cell controls its nuclear shape is unknown. Here, we use adhesive micropatterned surfaces to control the overall shape of fibroblasts and find that the shape of the nucleus is tightly regulated by the underlying cell adhesion geometry. We found that this regulation occurs through a dome-like actin cap that covers the top of the nucleus. This cap is composed of contractile actin filament bundles containing phosphorylated myosin, which form a highly organized, dynamic, and oriented structure in a wide variety of cells. The perinuclear actin cap is specifically disorganized or eliminated by inhibition of actomyosin contractility and rupture of the LINC complexes, which connect the nucleus to the actin cap. The organization of this actin cap and its nuclear shape-determining function are disrupted in cells from mouse models of accelerated aging (progeria) and muscular dystrophy with distorted nuclei caused by alterations of A-type lamins. These results highlight the interplay between cell shape, nuclear shape, and cell adhesion mediated by the perinuclear actin cap.

The evolutionary-conserved interactions between KASH and SUN domain-containing proteins within the perinuclear space establish physical connections, called LINC complexes, between the nucleus and the cytoskeleton. Here, we show that the KASH domains of Nesprins 1, 2 and 3 interact promiscuously with luminal domains of Sun1 and Sun2. These constructs disrupt endogenous LINC complexes as indicated by the displacement of endogenous Nesprins from the nuclear envelope. We also provide evidence that KASH domains most probably fit a pocket provided by SUN domains and that post-translational modifications are dispensable for that interaction. We demonstrate that the disruption of endogenous LINC complexes affect cellular mechanical stiffness to an extent that compares to the loss of mechanical stiffness previously reported in embryonic fibroblasts derived from mouse lacking A-type lamins, a mouse model of muscular dystrophies and cardiomyopathies. These findings support a model whereby physical connections between the nucleus and the cytoskeleton are mediated by interactions between diverse combinations of Sun proteins and Nesprins through their respective evolutionary-conserved domains. Furthermore, they emphasize, for the first time, the relevance of LINC complexes in cellular mechanical stiffness suggesting a possible involvement of their disruption in various laminopathies, a group of human diseases linked to mutations of A-type lamins.

Abstract To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force and be amenable to standard multiwell-plate manipulations. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom 3D-print-molded multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a circumferential ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen, which, in response to the gradual slope of the circumferential ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells, and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated the contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable the measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

ABSTRACT To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be amenable to standard multiwell-plate manipulations and be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom printed multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen which, in response to the slope of the ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

Cellular heterogeneity within the sinoatrial node (SAN) is functionally important but has been difficult to model in vitro , presenting a major obstacle to studies of heart rate regulation and arrhythmias. Here we describe a scalable method to derive sinoatrial node pacemaker cardiomyocytes (PCs) from human induced pluripotent stem cells that recapitulates differentiation into distinct PC subtypes, including SAN Head, SAN Tail, transitional zone cells, and sinus venosus myocardium. Single cell (sc) RNA-sequencing, sc-ATAC-sequencing, and trajectory analyses were used to define epigenetic and transcriptomic signatures of each cell type, and to identify novel transcriptional pathways important for PC subtype differentiation. Integration of our multi-omics datasets with genome wide association studies uncovered cell type-specific regulatory elements that associated with heart rate regulation and susceptibility to atrial fibrillation. Taken together, these datasets validate a novel, robust, and realistic in vitro platform that will enable deeper mechanistic exploration of human cardiac automaticity and arrhythmia.

We report the implementation of a parallel microscopy system (96 Eyes) that is capable of simultaneous imaging of all wells on a 96-well plate. The optical system consists of 96 microscopy units, where each unit is made out of a four element objective, made through a molded injection process, and a low cost CMOS camera chip. By illuminating the sample with angle varying light and applying Fourier Ptychography, we can improve the effective brightfield imaging numerical apertuure of the objectives from 0.23 to 0.3, and extend the depth of field from ±5μm to ±15μm. The use of Fourier Ptychography additionally allows us to computationally correct the objectives’ aberrations out of the rendered images, and provides us with the ability to render phase images. The 96 Eyes acquires raw data at a rate of 0.7 frame per second (all wells) and the data are processed with 4 cores of graphical processing units (GPUs; GK210, Nvidia Tesla K80, USA). The system is also capable of fluorescence imaging (excitation = 465nm, emission = 510nm) at the native resolution of the objectives. We demonstrate the capability of this system by imaging S1P1-eGFP-Human bone osteosarcoma epithelial (U2OS) cells.

Abstract The current state-of-the-art in hPSC culture is a bespoke and user-dependent process limiting the scale and complexity of the experiments performed and introducing operator-to-operator and day-to-day variation. Artificial intelligence (AI) offers the speed and flexibility to bridge the gap between a human-dependent process and industrial-scale automation. We evaluated an AI approach for counting exact cell numbers of undifferentiated human induced pluripotent stem cells in brightfield images for automating hPSC culture. The neural network generates a topological density map for accurate cell counts. We found that the image-based AI algorithm can determine a precise number of hPSCs and is superior to fluorescence-labeled object detection; the algorithm can ignore well edges, meniscus effects, and dust, achieving an average error of 5.6%. We have built a prototype capable of making a go/no go decision for stem cell passaging to perform 26,400 individual well-level counts from 422,400 images in 12 hours at low cost.