SUMMARY The meninges of the brain are an important component of neuroinflammatory response. Diverse immune cells move from the calvaria marrow into the dura mater via recently discovered skull-meninges connections (SMCs). However, how the calvaria bone marrow is different from the other bones and whether and how it contributes to human diseases remain unknown. Using multi-omics approaches and whole mouse transparency we reveal that bone marrow cells are highly heterogeneous across the mouse body. The calvaria harbors the most distinct molecular signature with hundreds of differentially expressed genes and proteins. Acute brain injury induces skull-specific alterations including increased calvaria cell numbers. Moreover, TSPO-positron-emission-tomography imaging of stroke, multiple sclerosis and neurodegenerative disease patients demonstrate disease-associated uptake patterns in the human skull, mirroring the underlying brain inflammation. Our study indicates that the calvaria is more than a physical barrier, and its immune cells may present new ways to control brain pathologies. Graphical Abstract Highlights Bone marrow across the mouse body display heterogeneity in their molecular profile Calvaria cells have a distinct profile that is relevant to brain pathologies Brain native proteins are identified in calvaria in pathological states TSPO-PET imaging of the human skull can be a proxy of neuroinflammation in the brain Supplementary Videos can be seen at: http://discotechnologies.org/Calvaria/

Abstract Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-based drug formulations are approved for the use in humans, however, the potential of PLGA to design nanoparticles (NPs) and target the central nervous system remains to be exploited. The aim of the current study was design PLGA NPs, loading them with bulky fluorophores thereby increasing single particle fluorescence to a level visible by in vivo microscopy, and investigate their brain biodistribution. We developed, highly fluorescent 70 nm PLGA NPs significantly brighter then quantum dots enabling their visualization by intravital real-time 2-photon microscopy. We found that PLGA NPs coated with pluronic F-68 (PF-68) had a substantially longer plasma half-life than uncoated NPs and were taken up by cerebro-vascular endothelial cells. High resolution confocal microscopy revealed that coated PLGA NPs were present in late endothelial endosomes of cerebral vessels within 1 hour after systemic injection and were more readily taken up by endothelial cells in peripheral organs. The current data suggest that PF-68 coated PLGA NPs are taken up by mouse cerebral and peripheral endothelial cells in vivo . The combination of ultra-bright NPs and in vivo imaging may thus represent a promising approach to reduce the gap between development and clinical application of nanoparticle-based drug carriers.

Abstract Incomplete reperfusion of the microvasculature (“no-reflow”) after ischemic stroke damages salvageable brain tissue. Previous ex-vivo studies suggest pericytes are vulnerable to ischemia and may exacerbate no-reflow, but the viability of pericytes and their association with no-reflow remains underexplored in vivo. Using longitudinal in vivo 2-photon single-cell imaging over seven days we show 87% of pericytes constrict during cerebral ischemia, remain constricted post-reperfusion and 50% of the pericyte population are acutely damaged. Moreover, we reveal ischemic pericytes are fundamentally implicated in capillary no-reflow by limiting and arresting blood flow within the first 24 hours post-stroke. Despite sustaining acute membrane damage, we observe up to 80% of cortical pericytes survive ischemia, upregulate unique transcriptomic profiles and replicate. Finally, we demonstrate delayed recovery of capillary diameter by ischemic pericytes after reperfusion predicts vessel reconstriction in the sub-acute phase of stroke. Cumulatively, these findings demonstrate surviving cortical pericytes remain both viable and promising therapeutic targets to counteract no-reflow after ischemic stroke.

ABSTRACT Targeting nanoparticle therapeutics with cellular accuracy in whole organisms could open breakthrough opportunities in precision medicine. However, evaluating and fine-tuning the biodistribution of such systems in the whole organism at the cellular level remains a major obstacle. Here, we constructed targetable DNA origami, and analyzed biodistribution in transparent mice, in addition to studying tolerability, clearance kinetics, and immune response parameters. Untargeted DNA origami primarily accumulated in the spleen and the liver, while an immune cell-targeting variant successfully attached to immune cells throughout the body. A cancer cell-targeting mimetic co-localized on solid-tumor metastasis in the liver and the lung. These findings indicate that DNA origami can be directed in vivo, providing an important proof-of-concept and highlights the potential of high-resolution tissue-clearing imaging technologies in their development. Graphical Abstract Highlights This study demonstrates the potential of DNA origami-based drug delivery systems as versatile tool for for targeted delivery, which could be used to treat a range of diseases with applications. The immune compatibility, half-life, targeting efficiency, and the biodistribution evaluation of DNA origami indicate its potential for systemic drug delivery. Our approach enables the assessment of biodistribution of nanoparticles in the intact body with a sensitivity to the single-cell level, highlighting the high-resolution tissue clearing technoloies in revealing DNA origami’s feasibility for drug targeting.

Abstract Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) is a central regulator of microglial activity and sequence variants are major risk factors for late onset Alzheimer’s disease (LOAD). To better understand the molecular and functional changes associated with TREM2 signalling, we generated a TREM2 reporter mouse model and observed a gradual upregulation of reporter expression with increasing plaque proximity. Isolated microglia were sorted based on reporter expression and their transcriptomic profiles acquired in both wildtype and APP transgenic animals, allowing us to disentangle TREM2 versus pathology-specific effects. Bulk RNA-sequencing highlighted TREM2 level-dependent changes in major immunometabolic pathways, with enrichment of genes in oxidative phosphorylation and cholesterol metabolism in microglia with increased TREM2 expression. To confirm these findings, we next analysed uptake of fluorodeoxyglucose (FDG) and examined metabolomic and lipidomic profiles. Again, independent of Aβ pathology, TREM2 expression correlated with uptake of FDG as well as increased cellular redox, energetics, and cholesterol homeostasis. Finally, we performed chronic treatment with a brain penetrant TREM2 agonist and identified a window of TREM2 expression where microglia are most responsive. Thus, our data provide novel insights into TREM2-mediated regulation of microglial metabolic function and informs current efforts to bring TREM2 agonists into clinical application.

Nanoparticles have a great potential to significantly improve the delivery of therapeutics to the brain and may also be equipped with properties to investigate brain function. The brain, being a highly complex organ shielded by selective barriers, requires its own specialized detection system. However, a significant hurdle to achieve these goals is still the identification of individual nanoparticles within the brain with sufficient cellular, subcellular, and temporal resolution. This review aims to provide a comprehensive summary of the current knowledge on detection systems for tracking nanoparticles across the blood-brain barrier and within the brain. We discuss commonly employed in vivo and ex vivo nanoparticle identification and quantification methods, as well as various imaging modalities able to detect nanoparticles in the brain. Advantages and weaknesses of these modalities as well as the biological factors that must be considered when interpreting results obtained through nanotechnologies are summarized. Finally, we critically evaluate the prevailing limitations of existing technologies and explore potential solutions.

Abstract Like other volume electron microscopy approaches, Automated Tape Collecting Ultramicrotomy (ATUM) enables imaging of serial sections deposited on thick plastic tapes by scanning electron microscopy (SEM). However, ATUM is unique by enabling hierarchical imaging and thus efficient screening for target structures as needed e.g., for correlated light and electron microscopy. However, SEM of sections on tape can only access the section surface, thereby limiting the axial resolution to the typical size of cellular vesicles, an order of magnitude lower than the acquired xy resolution. In contrast, serial-section electron tomography (ET), a transmission electron microscopy-based approach, yields isotropic voxels at full EM resolution, but requires deposition of sections on electron-permeant thin and fragile monolayer films – thus making screening of large section libraries difficult and prone to section loss. To combine the strength of both approaches, we developed ‘ATUM-Tomo’, a hybrid method, where sections are first reversibly attached to plastic tape via a dissolvable coating, and after screening detached and transferred to the ET-compatible thin films. Thus, ATUM-SEM of serial semi-thick sections and consecutive ET of one selected section combines SEM’s fast target recognition and coarse rendering capability with ET’s high-resolution volume visualizations – thus enabling multi-scale interrogation of cellular ultrastructure. As a proof-of-principle, we applied correlative ATUM-Tomo to study ultrastructural features of blood brain barrier (BBB) leakiness around microthrombi in a mouse model of traumatic brain injury. Microthrombi and associated sites of BBB leakiness were identified by confocal imaging of injected fluorescent and electron-dense nanoparticles, then relocalized by ATUM-SEM, and finally interrogated by correlated ATUM-Tomo, a workflow which created a seamless zoom-in on structural BBB pathology from the micro- to the nanometer scale. Overall, our new ATUM-Tomo approach will substantially advance ultrastructural analysis of biological phenomena that require cell- and tissue-level contextualization of the finest subcellular textures.

The kallikrein-kinin system is one of the first inflammatory pathways to be activated following traumatic brain injury (TBI) and has been shown to exacerbate brain edema formation in the acute phase through activation of bradykinin 2 receptors (B2R). However, the influence of B2R on chronic post-traumatic damage and outcome is unclear. In the current study, we assessed long-term effects of B2R-knockout (KO) after experimental TBI. B2R KO mice (heterozygous, homozygous) and wild-type (WT) littermates (

Abstract BACKGROUND In the intraluminal filament middle cerebral artery occlusion (fMCAo) model, there is considerable variability in infarct volumes, especially in C57BL/6 mice, which often lack the P1 segment of the posterior cerebral artery (PCA) and therefore develop not only MCA but also PCA area infarcts after fMCAo. Another factor contributing to infarct volume variability is collateral flow to the MCA area. The aim of this study was to establish an optimal surgical method to reduce the infarct volume variability in C57BL/6 mice. METHODS C57BL/6 mice were subjected to 60 min of fMCAo with cerebral blood flow monitored by laser Doppler fluxmetry. The influence of the common carotid artery (CCA) ligation, filament morphology, and the pterygopalatine artery (PPA) ligation on lesion volume and neurological severity score 24 hours after reperfusion were assessed. RESULT The use of filaments with appropriate length of coating and ligation of the PPA while maintaining perfusion of the CCA prevented the development of infarcts in the PCA area, resulted in pure MCA infarcts (68.3±14.5mm 3 , 26.1±3.6% of the hemisphere with Swanson’s correction) and reduced the variability of infarct volumes by more than half to 13.9% of the standard deviation divided by mean. CONCLUSIONS Using improved surgical methods with suitable filaments to induce MCA occlusion in mice, we were able to produce P CA area- u naffected re producible infarcts exclusively in the MCA area with reduced variability (PURE-MCAo). Our results may thus help to increase the reproducibility of the fMCAo model and reduce the number of animals required in preclinical stroke research.

Abstract Nanotechnology holds great promise to improve delivery of therapeutics to the brain. Current experimental approaches are, however, hampered by the lack of tools to dynamically monitor cargo delivery in vivo . We developed highly fluorescent lipid nanodroplets (LNDs) that carry a Förster-resonance energy transfer (FRET)-based drug delivery detection system able to monitor cargo release (FedEcs) in vivo . We investigated the distribution, stability, and cargo release of FedEcs-LNDs in the healthy and ischemic mouse brain by intravital multiphoton microscopy. We dynamically observed that LNDs accumulated within cerebral microclots after ischemia, caused by magnetic nanoparticles (Nano-stroke), and released their cargo. Furthermore, the blood-brain barrier (BBB) became permeable at sites of microclots thereby allowing FedEcs-LNDs to cross the BBB and to deliver their cargo to the brain parenchyma. Consequently, FedEcs represents a novel tool to quantitatively investigate the nanocarriers biodistribution and cargo release using intravital microscopy and may thus tremendously ease their translational validation.