Bacterial communities use "quorum sensing" (QS) to coordinate their population behavior through the action of extracellular signal molecules, such as the N-acyl-l-homoserine lactones (AHLs). The versatile and ubiquitous opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is a well-studied model for AHL-mediated QS. This species also produces an intercellular signal distinct from AHLs, 3,4-dihydroxy-2-heptylquinoline (PQS), which belongs to a family of poorly characterized 4-hydroxy-2-alkylquinolines (HAQs) previously identified for their antimicrobial activity. Here we use liquid chromatography (LC)/MS, genetics, and whole-genome expression to investigate the structure, biosynthesis, regulation, and activity of HAQs. We show that the pqsA-E operon encodes enzymes that catalyze the biosynthesis of five distinct classes of HAQs, and establish the sequence of synthesis of these compounds, which include potent cytochrome inhibitors and antibiotics active against human commensal and pathogenic bacteria. We find that anthranilic acid, the product of the PhnAB synthase, is the primary precursor of HAQs and that the HAQ congener 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HHQ) is the direct precursor of the PQS signaling molecule. Significantly, whereas phnAB and pqsA-E are positively regulated by the virulence-associated transcription factor MvfR, which is also required for the expression of several QS-regulated genes, the conversion of HHQ to PQS is instead controlled by LasR. Finally, our results reveal that HHQ is itself both released from, and taken up by, bacterial cells where it is converted into PQS, suggesting that it functions as a messenger molecule in a cell-to-cell communication pathway. HAQ signaling represents a potential target for the pharmacological intervention of P. aeruginosa-mediated infections.

Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous environmental bacterium and an important opportunistic human pathogen. Generally, the acquisition of genes in the form of pathogenicity islands distinguishes pathogenic isolates from nonpathogens. We therefore sequenced a highly virulent strain of P. aeruginosa, PA14, and compared it with a previously sequenced (and less pathogenic) strain, PAO1, to identify novel virulence genes. The PA14 and PAO1 genomes are remarkably similar, although PA14 has a slightly larger genome (6.5 megabses [Mb]) than does PAO1 (6.3 Mb). We identified 58 PA14 gene clusters that are absent in PAO1 to determine which of these genes, if any, contribute to its enhanced virulence in a Caenorhabditis elegans pathogenicity model. First, we tested 18 additional diverse strains in the C. elegans model and observed a wide range of pathogenic potential; however, genotyping these strains using a custom microarray showed that the presence of PA14 genes that are absent in PAO1 did not correlate with the virulence of these strains. Second, we utilized a full-genome nonredundant mutant library of PA14 to identify five genes (absent in PAO1) required for C. elegans killing. Surprisingly, although these five genes are present in many other P. aeruginosa strains, they do not correlate with virulence in C. elegans. Genes required for pathogenicity in one strain of P. aeruginosa are neither required for nor predictive of virulence in other strains. We therefore propose that virulence in this organism is both multifactorial and combinatorial, the result of a pool of pathogenicity-related genes that interact in various combinations in different genetic backgrounds.

Pseudomonas aeruginosa produces extracellular glycolipids composed of L-rhamnose and 3-hydroxyalkanoic acid called rhamnolipids. Although these compounds are usually regarded as biosurfactants or haemolysins, their exact physiological function is not well understood. Rhamnolipids are synthesized by a rhamnosyltransferase, encoded by the rhlAB operon, which catalyses the transfer of TDP-L-rhamnose to 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acid (HAA) moieties of various lengths. RhlB is the catalytic protein of the rhamnosyltransferase. rhlA is indispensable for rhamnolipid synthesis, but its function is unknown. Using a liquid chromatography/mass spectrometry method, the production of extracellular HAAs by P. aeruginosa was detected previously and it was demonstrated that they are the actual precursors of rhamnolipid biosynthesis. In this report, evidence is presented indicating that rhlA is required for production of HAAs and that these HAAs display potent surface-active properties. P. aeruginosa can colonize surfaces by swarming motility, a form of organized translocation requiring the production of wetting agents. Using rhlA and rhlB mutants it was observed that swarming requires the expression of the rhlA gene but does not necessitate rhamnolipid production, as HAAs act as surfactants. Finally, it was shown that the use of ammonium instead of nitrate as source of nitrogen and an excess of available iron both decrease rhlA expression and swarming motility.

Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous environmental bacterium capable of forming biofilms on surfaces as a survival strategy. It exhibits a large variety of competition/virulence factors, such as three types of motilities: flagellum-mediated swimming, flagellum-mediated swarming, and type IV pilus-mediated twitching. A strategy frequently used by bacteria to survive changing environmental conditions is to create a phenotypically heterogeneous population by a mechanism called phase variation. In this report, we describe the characterization of phenotypic variants forming small, rough colonies that spontaneously emerged when P. aeruginosa 57RP was cultivated as a biofilm or in static liquid cultures. These small-colony (S) variants produced abundant type IV fimbriae, displayed defective swimming, swarming, and twitching motilities, and were impaired in chemotaxis. They also autoaggregated in liquid cultures and rapidly initiated the formation of strongly adherent biofilms. In contrast, the large-colony variant (parent form) was poorly adherent, homogeneously dispersed in liquid cultures, and produced scant polar fimbriae. Further analysis of the S variants demonstrated differences in a variety of other phenotypic traits, including increased production of pyocyanin and pyoverdine and reduced elastase activity. Under appropriate growth conditions, cells of each phenotype switched to the other phenotype at a fairly high frequency. We conclude that these S variants resulted from phase variation and were selectively enriched when P. aeruginosa 57RP was grown as a biofilm or in static liquid cultures. We propose that phase variation ensures the prior presence of phenotypic forms well adapted to initiate the formation of a biofilm as soon as environmental conditions are favorable.

Opportunistic infections are often polymicrobial. Two of the most important bacterial opportunistic pathogens of humans, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus , frequently are coisolated from infections of catheters, endotracheal tubes, skin, eyes, and the respiratory tract, including the airways of people with cystic fibrosis (CF). Here, we show that suppression of S. aureus respiration by a P. aeruginosa exoproduct, 4-hydroxy-2-heptylquinoline- N -oxide (HQNO), protects S. aureus during coculture from killing by commonly used aminoglycoside antibiotics such as tobramycin. Furthermore, prolonged growth of S. aureus with either P. aeruginosa or with physiological concentrations of pure HQNO selects for typical S. aureus small-colony variants (SCVs), well known for stable aminoglycoside resistance and persistence in chronic infections, including those found in CF. We detected HQNO in the sputum of CF patients infected with P. aeruginosa , but not in uninfected patients, suggesting that this HQNO-mediated interspecies interaction occurs in CF airways. Thus, in all coinfections with P. aeruginosa , S. aureus may be underappreciated as a pathogen because of the formation of antibiotic-resistant and difficult to detect small-colony variants. Interspecies microbial interactions, analogous to those mediated by HQNO, commonly may alter not only the course of disease and the response to therapy, but also the population structure of bacterial communities that promote the health of host animals, plants, and ecosystems.

Summary The transcriptional regulator MvfR is required for full Pseudomonas aeruginosa virulence, the function of multiple quorum sensing (QS)‐regulated virulence factors and the synthesis of 4‐hydroxy‐2‐alkylquinolines (HAQs), including the Pseudomonas quinolone signal (PQS). Here we investigate the role of MvfR in the QS circuitry and P. aeruginosa pathogenesis. We demonstrate using a combination of biochemical and molecular approaches, including transcription profiling, that MvfR is involved in the regulation of multiple P. aeruginosa QS‐controlled genes without altering the expression of lasRI / rhlRI or the production of N ‐acyl‐ l ‐homoserine lactone (AHL) signals. Dissection of how mvfR is interwoven into the P. aeruginosa QS circuitry reveals that the MvfR system, through the essential contribution of PqsE, positively regulates a subset of genes dependant on both LasR and RhlR. Animal studies show that MvfR contributes to P. aeruginosa virulence by controlling the transcription of genes not under RhlR regulation, and that reduced virulence of a mvfR mutant is caused by the loss of pqsE expression and not only a deficiency in HAQs/PQS production. This study provides novel insights into the unique role of the MvfR system in AHL‐mediated QS and further supports its importance in P. aeruginosa pathogenesis.

The ubiquitous bacterium Pseudomonas aeruginosa is the quintessential opportunistic pathogen. Certain isolates infect a broad range of host organisms, from plants to humans. The pathogenic promiscuity of particular variants may reflect an increased virulence gene repertoire beyond the core P. aeruginosa genome. We have identified and characterized two P. aeruginosa pathogenicity islands (PAPI-1 and PAPI-2) in the genome of PA14, a highly virulent clinical isolate. The 108-kb PAPI-1 and 11-kb PAPI-2, which are absent from the less virulent reference strain PAO1, exhibit highly modular structures, revealing their complex derivations from a wide array of bacterial species and mobile elements. Most of the genes within these islands that are homologous to known genes occur in other human and plant bacterial pathogens. For example, PAPI-1 carries a complete gene cluster predicted to encode a type IV group B pilus, a well known adhesin absent from strain PAO1. However, >80% of the PAPI-1 DNA sequence is unique, and 75 of its 115 predicted ORF products are unrelated to any known proteins or functional domains. Significantly, many PAPI-1 ORFs also occur in several P. aeruginosa cystic fibrosis isolates. Twenty-three PAPI ORFs were mutated, and 19 were found to be necessary for full plant or animal virulence, with 11 required for both. The large set of “extra” virulence functions encoded by both PAPIs may contribute to the increased promiscuity of highly virulent P. aeruginosa strains, by directing additional pathogenic functions.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen capable of forming a biofilm under physiological conditions that contributes to its persistence despite long-term treatment with antibiotics. Here, we report that pathogenic P. aeruginosa strains PAO1 and PA14 are capable of infecting the roots of Arabidopsis and sweet basil (Ocimum basilicum), in vitro and in the soil, and are capable of causing plant mortality 7 d postinoculation. Before plant mortality, PAO1 and PA14 colonize the roots of Arabidopsis and sweet basil and form a biofilm as observed by scanning electron microscopy, phase contrast microscopy, and confocal scanning laser microscopy. Upon P. aeruginosa infection, sweet basil roots secrete rosmarinic acid (RA), a multifunctional caffeic acid ester that exhibits in vitro antibacterial activity against planktonic cells of both P. aeruginosa strains with a minimum inhibitory concentration of 3 microg mL(-1). However, in our studies RA did not attain minimum inhibitory concentration levels in sweet basil's root exudates before P. aeruginosa formed a biofilm that resisted the microbicidal effects of RA and ultimately caused plant mortality. We further demonstrated that P. aeruginosa biofilms were resistant to RA treatment under in vivo and in vitro conditions. In contrast, induction of RA secretion by sweet basil roots and exogenous supplementation of Arabidopsis root exudates with RA before infection conferred resistance to P. aeruginosa. Under the latter conditions, confocal scanning laser microscopy revealed large clusters of dead P. aeruginosa on the root surface of Arabidopsis and sweet basil, and biofilm formation was not observed. Studies with quorum-sensing mutants PAO210 (DeltarhlI), PAO214 (DeltalasI), and PAO216 (DeltalasI DeltarhlI) demonstrated that all of the strains were pathogenic to Arabidopsis, which does not naturally secrete RA as a root exudate. However, PAO214 was the only pathogenic strain toward sweet basil, and PAO214 biofilm appeared comparable with biofilms formed by wild-type strains of P. aeruginosa. Our results collectively suggest that upon root colonization, P. aeruginosa forms a biofilm that confers resistance against root-secreted antibiotics.

ABSTRACT The saprophyte Pseudomonas aeruginosa is a versatile opportunistic pathogen causing infections in immunocompromised individuals. To facilitate its adaptation to a large variety of niches, this bacterium exploits population density-dependant gene regulation systems called quorum sensing. In P. aeruginosa , three distinct but interrelated quorum sensing systems ( las , rhl and pqs ) regulate the production of many survival and virulence functions. In prototypical strains, the las system, through its transcriptional regulator LasR, is important for the full activation of the rhl and pqs systems. Still, LasR-deficient isolates have been reported, mostly sampled from the lungs of people with cystic fibrosis, where they are considered selected by the chronic infection environment. In this study, we show that a defect in LasR activity appears to be an actually widespread mechanism of adaptation in this bacterium. Indeed, we found abundant LasR-defective isolates sampled from hydrocarbon-contaminated soils, hospital sink drains, and meat/fish market environments, using an approach based on phenotypic profiling, supported by gene sequencing. Interestingly, several LasR-defective isolates maintain an active rhl system or are deficient in pqs system signaling. The high prevalence of a LasR-defective phenotype among environmental P. aeruginosa isolates questions the role of quorum sensing in niche adaptation.

ABSTRACT A subpopulation of Small Colony Variants (SCVs) is a frequently observed feature of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis (CF) lungs biofilms. SCVs have almost exclusively been reported from infected hosts, essentially CF individuals or, by extension, from laboratory cultivation of strains originated from infected hosts. We previously reported the identification of P. aeruginosa SCVs emerging from a non-clinical strain and displaying features shared with clinical SCVs. In the present work, we investigated the ability of 22 P. aeruginosa isolates from various environmental origins to, under laboratory culture conditions, spontaneously adopt a SCV-like smaller alternative morphotype distinguishable from the ancestral parent strain. Unexpectedly, we found that all the P. aeruginosa strains tested have the ability to adopt a SCV morphotype, regardless of their origin. Based on the phenotypes already described for SCVs, the SCV-like morphotypes obtained were clustered in two groups displaying various phenotypic profiles, including one characteristic of already described SCVs. We conclude that the ability to switch to a SCV phenotype is a conserved feature in Pseudomonas aeruginosa . IMPORTANCE P. aeruginosa is an opportunistic pathogen that thrives in many environments. It is significant public health concern, notably because it is the most prevalent pathogen found in the lungs of people with cystic fibrosis (CF). In infected hosts, its persistence is believed to be related to the emergence of an alternative small colony variant (SCV) phenotype. By reporting the distribution of P. aeruginosa SCVs in various non-clinical environments, this work contributes to understanding a conserved adaptation mechanism used by P. aeruginosa to rapidly adapt in all environments. Counteraction of this strategy could prevent P. aeruginosa persistent infection in the future.