Autophagy is the cellular homeostatic pathway that delivers large cytosolic materials for degradation in the lysosome. Recent evidence indicates that autophagy mediates selective removal of protein aggregates, organelles and microbes in cells. Yet, the specificity in targeting a particular substrate to the autophagy pathway remains poorly understood. Here, we show that the mitochondrial protein Nix is a selective autophagy receptor by binding to LC3/GABARAP proteins, ubiquitin‐like modifiers that are required for the growth of autophagosomal membranes. In cultured cells, Nix recruits GABARAP‐L1 to damaged mitochondria through its amino‐terminal LC3‐interacting region. Furthermore, ablation of the Nix:LC3/GABARAP interaction retards mitochondrial clearance in maturing murine reticulocytes. Thus, Nix functions as an autophagy receptor, which mediates mitochondrial clearance after mitochondrial damage and during erythrocyte differentiation.

Degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra is characteristic for Parkinson's disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder. Mitochondrial dysfunction is believed to contribute to the etiology of PD. Although most cases are sporadic, recent evidence points to a number of genes involved in familial variants of PD. Among them, a loss-of-function of phosphatase and tensin homolog-induced kinase 1 (PINK1; PARK6) is associated with rare cases of autosomal recessive parkinsonism. In HeLa cells, RNA interference-mediated downregulation of PINK1 results in abnormal mitochondrial morphology and altered membrane potential. Morphological changes of mitochondria can be rescued by expression of wild-type PINK1 but not by PD-associated PINK1 mutants. Moreover, primary cells derived from patients with two different PINK1 mutants showed a similar defect in mitochondrial morphology. Human parkin but not PD-associated mutants could rescue mitochondrial pathology in human cells like wild-type PINK1. Our results may therefore suggest that PINK1 deficiency in humans results in mitochondrial abnormalities associated with cellular stress, a pathological phenotype, which can be ameliorated by enhanced expression of parkin.

Many muscular and neurological disorders are associated with mitochondrial dysfunction and are often accompanied by changes in mitochondrial morphology. Mutations in the gene encoding OPA1, a protein required for fusion of mitochondria, are associated with hereditary autosomal dominant optic atrophy type I. Here we show that mitochondrial fragmentation correlates with processing of large isoforms of OPA1 in cybrid cells from a patient with myoclonus epilepsy and ragged-red fibers syndrome and in mouse embryonic fibroblasts harboring an error-prone mitochondrial mtDNA polymerase γ. Furthermore, processed OPA1 was observed in heart tissue derived from heart-specific TFAM knock-out mice suffering from mitochondrial cardiomyopathy and in skeletal muscles from patients suffering from mitochondrial myopathies such as myopathy encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episodes. Dissipation of the mitochondrial membrane potential leads to fast induction of proteolytic processing of OPA1 and concomitant fragmentation of mitochondria. Recovery of mitochondrial fusion depended on protein synthesis and was accompanied by resynthesis of large isoforms of OPA1. Fragmentation of mitochondria was prevented by overexpressing OPA1. Taken together, our data indicate that proteolytic processing of OPA1 has a key role in inducing fragmentation of energetically compromised mitochondria. We present the hypothesis that this pathway regulates mitochondrial morphology and serves as an early response to prevent fusion of dysfunctional mitochondria with the functional mitochondrial network. Many muscular and neurological disorders are associated with mitochondrial dysfunction and are often accompanied by changes in mitochondrial morphology. Mutations in the gene encoding OPA1, a protein required for fusion of mitochondria, are associated with hereditary autosomal dominant optic atrophy type I. Here we show that mitochondrial fragmentation correlates with processing of large isoforms of OPA1 in cybrid cells from a patient with myoclonus epilepsy and ragged-red fibers syndrome and in mouse embryonic fibroblasts harboring an error-prone mitochondrial mtDNA polymerase γ. Furthermore, processed OPA1 was observed in heart tissue derived from heart-specific TFAM knock-out mice suffering from mitochondrial cardiomyopathy and in skeletal muscles from patients suffering from mitochondrial myopathies such as myopathy encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episodes. Dissipation of the mitochondrial membrane potential leads to fast induction of proteolytic processing of OPA1 and concomitant fragmentation of mitochondria. Recovery of mitochondrial fusion depended on protein synthesis and was accompanied by resynthesis of large isoforms of OPA1. Fragmentation of mitochondria was prevented by overexpressing OPA1. Taken together, our data indicate that proteolytic processing of OPA1 has a key role in inducing fragmentation of energetically compromised mitochondria. We present the hypothesis that this pathway regulates mitochondrial morphology and serves as an early response to prevent fusion of dysfunctional mitochondria with the functional mitochondrial network. Mitochondria fulfill a number of essential functions in the eukaryotic cell. One such process is oxidative phosphorylation, a process that generates the vast majority of cellular ATP. Therefore, it is not surprising that many muscular and neurological disorders, various forms of cancer, diabetes, obesity, and aging, are associated with mitochondrial dysfunction (1Wallace D.C. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 359-407Crossref PubMed Scopus (2530) Google Scholar, 6DiMauro S. Schon E.A. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 2656-2668Crossref PubMed Scopus (1293) Google Scholar). Interestingly, in many of these diseases or conditions aberrant mitochondrial morphologies are observed (1Wallace D.C. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 359-407Crossref PubMed Scopus (2530) Google Scholar, 7DiMauro S. Bonilla E. Zeviani M. Nakagawa M. DeVivo D.C. Ann. Neurol. 1985; 17: 521-538Crossref PubMed Scopus (678) Google Scholar). Mitochondria in numerous cell types form a large network of interconnected tubules that is maintained by a balance of fission and fusion events (8Nunnari J. Marshall W.F. Straight A. Murray A. Sedat J.W. Walter P. Mol. Biol. Cell. 1997; 8: 1233-1242Crossref PubMed Scopus (402) Google Scholar, 9Okamoto K. Shaw J.M. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 503-536Crossref PubMed Scopus (594) Google Scholar). Deficiencies in mitochondrial fusion and fission play an important role in various neurodegenerative diseases such as Charcot-Marie-Tooth disease type 2A and 4A, and optic atrophy type 1 (10Alexander C. Votruba M. Pesch U.E. Thiselton D.L. Mayer S. Moore A. Rodriguez M. Kellner U. Leo-Kottler B. Auburger G. Bhattacharya S.S. Wissinger B. Nat. Genet. 2000; 26: 211-215Crossref PubMed Scopus (1056) Google Scholar, 13Niemann A. Ruegg M. La Padula V. Schenone A. Suter U. J. Cell Biol. 2005; 170: 1067-1078Crossref PubMed Scopus (331) Google Scholar). Furthermore, these dynamic processes apparently are crucial for the cell, e.g. in apoptosis (14Karbowski M. Lee Y.J. Gaume B. Jeong S.Y. Frank S. Nechushtan A. Santel A. Fuller M. Smith C.L. Youle R.J. J. Cell Biol. 2002; 159: 931-938Crossref PubMed Scopus (671) Google Scholar, 18Arnoult D. Grodet A. Lee Y.J. Estaquier J. Blackstone C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 35742-35750Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (224) Google Scholar), formation of dendritic spines and synapses (19Verstreken P. Ly C.V. Venken K.J. Koh T.W. Zhou Y. Bellen H.J. Neuron. 2005; 47: 365-378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (630) Google Scholar, 20Li Z. Okamoto K. Hayashi Y. Sheng M. Cell. 2004; 119: 873-887Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1126) Google Scholar), and functional complementation of mtDNA mutations by content mixing (21Nakada K. Inoue K. Ono T. Isobe K. Ogura A. Goto Y.I. Nonaka I. Hayashi J.I. Nat. Med. 2001; 7: 934-940Crossref PubMed Scopus (343) Google Scholar, 22Ono T. Isobe K. Nakada K. Hayashi J.I. Nat. Genet. 2001; 28: 272-275Crossref PubMed Scopus (336) Google Scholar). Fusion of mitochondria, in particular of the inner mitochondrial membrane, depends on the presence of a mitochondrial membrane potential (23Malka F. Guillery O. Cifuentes-Diaz C. Guillou E. Belenguer P. Lombes A. Rojo M. EMBO Rep. 2005; 6: 853-859Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 26Legros F. Lombes A. Frachon P. Rojo M. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4343-4354Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar). Still it is unclear how mitochondrial dysfunction and fragmentation of mitochondria are linked on a molecular level. Here we report on a major molecular player, namely OPA1, in this process. Mutations in the OPA1 gene are known to cause hereditary autosomal dominant optic atrophy type I, the most prevalent hereditary neuropathy of the optic nerve occurring with a prevalence of 1:12,000 to 1:50,000, depending on the population (10Alexander C. Votruba M. Pesch U.E. Thiselton D.L. Mayer S. Moore A. Rodriguez M. Kellner U. Leo-Kottler B. Auburger G. Bhattacharya S.S. Wissinger B. Nat. Genet. 2000; 26: 211-215Crossref PubMed Scopus (1056) Google Scholar, 11Delettre C. Lenaers G. Griffoin J.M. Gigarel N. Lorenzo C. Belenguer P. Pelloquin L. Grosgeorge J. Turc-Carel C. Perret E. Astarie-Dequeker C. Lasquellec L. Arnaud B. Ducommun B. Kaplan J. Hamel C.P. Nat. Genet. 2000; 26: 207-210Crossref PubMed Scopus (1149) Google Scholar). The OPA1 protein is required for mitochondrial fusion (27Olichon A. Baricault L. Gas N. Guillou E. Valette A. Belenguer P. Lenaers G. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7743-7746Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (877) Google Scholar, 29Chen H. Chomyn A. Chan D.C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 26185-26192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1008) Google Scholar). Overexpression of OPA1 in mouse embryo fibroblasts promotes tubulation of mitochondria (28Cipolat S. de Brito O.M. Dal Zilio B. Scorrano L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 15927-15932Crossref PubMed Scopus (904) Google Scholar). Down-regulation of OPA1 leads to fragmentation of mitochondria, mitochondrial dysfunction, altered mitochondrial inner membrane morphology, and increased propensity for apoptosis (15Lee Y.J. Jeong S.Y. Karbowski M. Smith C.L. Youle R.J. Mol. Biol. Cell. 2004; 15: 5001-5011Crossref PubMed Scopus (851) Google Scholar, 18Arnoult D. Grodet A. Lee Y.J. Estaquier J. Blackstone C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 35742-35750Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (224) Google Scholar, 27Olichon A. Baricault L. Gas N. Guillou E. Valette A. Belenguer P. Lenaers G. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7743-7746Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (877) Google Scholar, 29Chen H. Chomyn A. Chan D.C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 26185-26192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1008) Google Scholar, 30van der Griparic L. Wel N.N. Orozco I.J. Peters P.J. van der Bliek A.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 18792-18798Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar). Eight alternatively spliced mRNAs transcribed from the OPA1 gene and several tissue-specific isoforms of the OPA1 protein were described (31Satoh M. Hamamoto T. Seo N. Kagawa Y. Endo H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 300: 482-493Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 32Olichon A. Emorine L.J. Descoins E. Pelloquin L. Brichese L. Gas N. Guillou E. Delettre C. Valette A. Hamel C.P. Ducommun B. Lenaers G. Belenguer P. FEBS Lett. 2002; 523: 171-176Crossref PubMed Scopus (330) Google Scholar). The ortholog of OPA1 in bakers' yeast, Mgm1, is essential for mitochondrial fusion (33Wong E.D. Wagner J.A. Scott S.V. Okreglak V. Holewinske T.J. Cassidy-Stone A. Nunnari J. J. Cell Biol. 2003; 160: 303-311Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar, 34Sesaki H. Southard S.M. Yaffe M.P. Jensen R.E. Mol. Biol. Cell. 2003; 14: 2342-2356Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar) and is present in two proteolytically matured isoforms, l-Mgm1 and s-Mgm1, both of which are required for function (35Herlan M. Vogel F. Bornhövd C. Neupert W. Reichert A.S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 27781-27788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (297) Google Scholar). Formation of s-Mgm1 depends on an ATP-dependent mechanism termed alternative topogenesis (36Herlan M. Bornhövd C. Hell K. Neupert W. Reichert A.S. J. Cell Biol. 2004; 165: 167-173Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). Therefore, the bioenergetic state of mitochondria was proposed to be linked to their morphology. Here we report that in mouse and human the orthologous protein OPA1 has a key role in linking the bioenergetic state of mitochondria to mitochondrial morphology, albeit in a mechanistically distinct manner. Cell Culture and Reagents—HeLa cells, human fibroblasts, immortalized mouse embryonic fibroblast from control (mouse embryonic fibroblast cell lines 13 and 14) and mutator mice (mouse embryonic fibroblast cell lines 2 and 7) (37Trifunovic A. Wredenberg A. Falkenberg M. Spelbrink J.N. Rovio A.T. Bruder C.E. Bohlooly Y.M. Gidlof S. Oldfors A. Wibom R. Tornell J. Jacobs H.T. Larsson N.G. Nature. 2004; 429: 417-423Crossref PubMed Scopus (2020) Google Scholar, 38Trifunovic A. Hansson A. Wredenberg A. Rovio A.T. Dufour E. Khvorostov I. Spelbrink J.N. Wibom R. Jacobs H.T. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 17993-17998Crossref PubMed Scopus (432) Google Scholar) and cybrid cell lines (pT1 and pT3) (39Chomyn A. Meola G. Bresolin N. Lai S.T. Scarlato G. Attardi G. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 2236-2244Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar) were grown under standard conditions in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 4.5 g/liter glucose and 2 mm l-glutamine supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 units/ml penicillin, and 50 μg/ml streptomycin. Cell culture reagents were obtained from PAA Laboratories (Cölbe, Germany); CCCP, 2The abbreviations used are: CCCP, carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone; GFP, green fluorescent protein; MERRF, myoclonus epilepsy and ragged-red fibers syndrome; CHX, cycloheximide; MELAS, myopathy encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episode. o-phenanthroline, and cycloheximide were purchased from Sigma, and phenylmethylsulfonyl fluoride was from Serva (Germany). The plasmid pMSCV-Opa1, encoding a mouse variant of OPA1 corresponding to human spliceform 1, was a kind gift of Luca Scorrano (Padova, Italy) (28Cipolat S. de Brito O.M. Dal Zilio B. Scorrano L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 15927-15932Crossref PubMed Scopus (904) Google Scholar). The DRP1K38E N-terminally fused to cyan fluorescent protein (pECFP-C1-DVLPK38E) and mitochondrially targeted GFP plasmids (pcDNA3-OCT:GFP) were kind gifts of Heidi McBride (Ottawa Heart Institute, Canada). Transient transfections of HeLa cells were performed using Metafectene (Biontex Laboratories, Germany) or FuGENE HD (Roche Applied Science). Tissue Samples—Heart tissue was obtained from heart-specific TFAM knock-out mice as described earlier (40Hansson A. Hance N. Dufour E. Rantanen A. Hultenby K. Clayton D.A. Wibom R. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3136-3141Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar). Skeletal muscle biopsies were derived from patients diagnosed with respiratory chain disorders (patients 1-10) or control patients (control patients A-D) with no such defects. Informed consent was given by all patients. Patients 1-10 included in this study were previously diagnosed with respiratory chain disorders suffering from mitochondrial encephalomyopathies or isolated myopathies on the basis of clinical, biochemical, morphological, and, in some cases, genetic findings. The activities of the respiratory chain complexes of all control patients were within the normal range. Measurements of rotenone-sensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I), succinate-cytochrome c oxidoreductase (complexes II and III). and cytochrome c oxidase (complex IV) were determined spectrophotometrically in skeletal muscle homogenates according to Fischer et al. (41Fischer J.C. Ruitenbeek W. Gabreels F.J. Janssen A.J. Renier W.O. Sengers R.C. ter Stadhouders A.M. Laak H.J. Trijbels J.M. Veerkamp J.H. Eur. J. Pediatr. 1986; 144: 441-444Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). Activities were expressed as units per gram of noncollagenous protein and related to the mitochondrial marker enzyme citrate synthase. Homogenates from skeletal muscle biopsies were analyzed by Western blotting, and band intensities were determined densitometrically from the immunoblot. Antibodies—Anti-OPA1 antibodies were affinity-purified from a rabbit polyclonal serum raised against the C terminus of human OPA1 using the synthetic peptide CDLKKVREIQEKLDAFIEALHQEK (Pineda Antikörper-Service, Berlin). Antibodies against human MIA40 were raised in rabbits using purified MIA40 fused to maltose-binding protein. Polyclonal rabbit sera against hTim23 and hTim44 were raised as described previously (42Bauer M.F. Gempel K. Reichert A.S. Rappold G.A. Lichtner P. Gerbitz K.D. Neupert W. Brunner M. Hofmann S. J. Mol. Biol. 1999; 289: 69-82Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). Mouse anti cytochrome c (clone 7H8.2C12; BD Biosciences), anti-DRP1 (DLP1 clone 8; BD Biosciences), and anti-β-actin (clone AC-15; Sigma) monoclonal antibodies were used for immunoblotting. The goat anti-AIF (D-20) and rabbit anti-Fis1 sera were purchased from Santa Cruz Biotechnology and IMGENEX, respectively. The anti-Mfn2 serum was a kind gift of Antonio Zorzano (University of Barcelona, Spain). Fluorescence Microscopy—Live cells were fluorescently labeled with MitoTracker® Red CMXRos (Molecular Probes) for mitochondria or with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (Molecular Probes) for the nucleus after fixation and permeabilization. Immunostaining was carried out with mouse anti-cytochrome c monoclonal antibody (clone 6H2.B4; BD Biosciences) and chicken anti-GFP antibody (Aves Lab Inc.). The following secondary antibodies conjugated to fluorescent dyes were used: Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (Molecular Probes), Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L), and fluorescein isothiocyanate-conjugated donkey anti-chicken IgG (Jackson ImmunoResearch). Cells were mounted with Prolong® Gold antifade reagent (Molecular Probes). All treatments were done according to the manufacturers' instructions. Mitochondrial morphology was analyzed by confocal microscopy using a Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany) equipped with a ×63 objective. For all imaging, 512 × 512 pixel images of single confocal planes were acquired and processed with the Bitplane Imaris 4 software. At least 100 cells were analyzed for each slide of each condition or cell line. Error bars represent standard deviations calculated from three to five slides. Pulse-Chase Experiments—HeLa cells were seeded on 6-well plates (105 cells per well). One day later, the cells were washed two times with phosphate-buffered saline and starved for 30 min in Dulbecco's modified Eagle's medium without sodium pyruvate, l-methionine, and l-cystine (Invitrogen). Pulse labeling was started by addition of the metabolic labeling reagent (Tran35S-label, MP Biochemicals Europe), and cells were incubated for 2 h 30 min, washed twice with phosphate-buffered saline, and either harvested at that time point or incubated further with complete Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, harvested, lysed in lysis buffer (0.5% Triton X-100, 150 mm NaCl, 10 mm Tris/HCl, 5 mm EDTA, supplemented with complete protease inhibitor mixture purchased from Roche Applied Science), and submitted to immunoprecipitation with OPA1 antibodies and protein A-Sepharose CL-4B beads (Amersham Biosciences). Preimmune serum was used in control experiments. The elution fractions of the different immunoprecipitation experiments were analyzed by Western blotting and digital autoradiography after SDS-PAGE using the same membrane. Subcellular Fractionation of Cells—Cells were harvested, washed in phosphate-buffered saline supplemented with 5 mm EDTA, and resuspended in 1 ml of RSB buffer (10 mm HEPES (pH 7.5), 1 mm EDTA, 210 mm mannitol, 70 mm sucrose, supplemented with complete protease inhibitor mixture). Cells were broken by six passages through a 26-gauge needle fitted to a 5-ml syringe. Cell pellets from low speed centrifugations (2,000 × g, 10 min, 4 °C) were resuspended in RSB buffer and passaged again through a needle as described. This step was repeated 3 to 4 times. The supernatants from low speed centrifugations were pooled and centrifuged again (13,000 × g, 10 min, 4 °C) to obtain a crude mitochondrial pellet and a cytosolic supernatant. MERRF Cybrid Cells Show Fragmentation of Mitochondria and Alterations in OPA1 Isoforms—In a first approach to study the molecular mechanism of fragmentation of mitochondria in human diseases, we investigated the role of fusion-promoting OPA1 in a cybrid cell line derived from a MERRF patient suffering from severe myopathy (39Chomyn A. Meola G. Bresolin N. Lai S.T. Scarlato G. Attardi G. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 2236-2244Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar). The mtDNA in the cell line contained the A8344G mutation in the tRNALys in a nearly homoplasmic manner leading to a substantial impairment of mitochondrial function (39Chomyn A. Meola G. Bresolin N. Lai S.T. Scarlato G. Attardi G. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 2236-2244Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar). The cells from the MERRF patient, but not control cells, showed highly fragmented mitochondria (Fig. 1, a and b). The pattern of the five detected OPA1 protein isoforms was altered in the MERRF cells compared with control cells (Fig. 1c). It appears that in the MERRF cells the larger isoforms are reduced compared with the smallest isoform of OPA1. As OPA1 is required for mitochondrial fusion, the observed loss of large OPA1 isoforms may explain the fragmentation of mitochondria in this model system of mitochondrial dysfunction. Mutator Mouse Embryonic Fibroblasts Show Fragmentation of Mitochondria and Alterations in OPA1 Isoforms—To further substantiate this, we analyzed immortalized mouse embryonic fibroblasts derived from the so-called “mutator mouse” (37Trifunovic A. Wredenberg A. Falkenberg M. Spelbrink J.N. Rovio A.T. Bruder C.E. Bohlooly Y.M. Gidlof S. Oldfors A. Wibom R. Tornell J. Jacobs H.T. Larsson N.G. Nature. 2004; 429: 417-423Crossref PubMed Scopus (2020) Google Scholar, 38Trifunovic A. Hansson A. Wredenberg A. Rovio A.T. Dufour E. Khvorostov I. Spelbrink J.N. Wibom R. Jacobs H.T. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 17993-17998Crossref PubMed Scopus (432) Google Scholar). This mouse was generated by a homozygous knock-in of a variant of mtDNA polymerase γ resulting in a phenotype of premature aging. The variant enzyme has much reduced proofreading activity, and mtDNA accumulates random point mutations at a 3-5-fold higher rate than normal leading to severe mitochondrial dysfunction. Mitochondria were extensively fragmented in mutator but not in control cell lines (Fig. 2, a and b). The levels of the larger OPA1 isoforms were strongly reduced, whereas the levels of the smaller forms were increased in the mutant cells (Fig. 2c). These findings suggest that mutations in mtDNA are causative to changes in OPA1 isoform levels and mitochondrial fragmentation. Patterns of OPA1 Isoforms Are Altered in Tissue Samples Exemplary of Mitochondrial Dysfunction—TFAM is an essential mitochondrial transcription factor also required for mtDNA maintenance. A heart-specific knock-out of TFAM in mice led to a severe depletion of mtDNA in the heart, resulting in cardiomyopathy and altered mitochondrial morphology (40Hansson A. Hance N. Dufour E. Rantanen A. Hultenby K. Clayton D.A. Wibom R. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3136-3141Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar). The pattern of OPA1 isoforms in heart tissue of these mice was changed as compared with controls; the abundance of larger OPA1 isoforms was reduced, whereas that of smaller isoforms was increased (Fig. 3a). This was even more pronounced at 8 weeks compared with 4 weeks of age (Fig. 3a), consistent with the progression of the cardiomyopathy in those mice (40Hansson A. Hance N. Dufour E. Rantanen A. Hultenby K. Clayton D.A. Wibom R. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3136-3141Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar). This shows that mitochondrial dysfunction resulting from mtDNA depletion is linked to the reduction of larger OPA1 isoforms in the affected tissue. Moreover, the alterations of mitochondrial morphology observed earlier by electron microscopy (40Hansson A. Hance N. Dufour E. Rantanen A. Hultenby K. Clayton D.A. Wibom R. Larsson N.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3136-3141Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar) are likely because of the shift in the levels of OPA1 isoforms. In addition, we checked whether alterations in the OPA1 isoform pattern are detectable in patients diagnosed with respiratory chain defects. Indeed, an increase of smaller OPA1 isoforms was observed in skeletal muscle from these patients but not from controls (Fig. 3b). This was quantified by determining the ratios of the amounts of the smallest OPA1 isoform (arrow in Fig. 3b) to the total of all OPA1 isoforms (Fig. 3c). Besides the shift patients exhibited a much broader variation compared with controls. The patients with mitochondrial DNA depletion syndromes or harboring a MELAS mutation were among those with the highest ratios (Fig. 3c, patients 1 and 7 and Table 1). In none of the controls did we observe such a shift. We conclude that OPA1 isoforms are altered in patients with mitochondrial disorders, in particular those with depletion of or mutations in mtDNA.TABLE 1Genetic and biochemical analysis of mitochondrial function in skeletal muscle biopsies from patients and controlsSamplesRespiratory chain enzyme activitiesGeneticsRelative amount of smallest OPA1 isoform of total%ANormal6.7CNormal7.5BNormal10.7DNormal14.75I, 10%Unknown14.79I, 80%II/III, 40%IV, 20%Unknown16.32IV, 20%Unknown17.38I, 70%II/III, 60%IV, 10%A1541G mutation in SCO218.76I, 30%Unknown22.14I, 30%IV, 30%mtDNA depletion22.73I, 30%II/III, 80%IV, 30%Unknown22.910I, 50%II/III, 50%IV, 20%mtDNA depletion23.57I, 50%II/III, 50%IV, 80%MELAS A3243G mutation in tRNA-Leu(UUR)39.71I, 50%II/III, 50%IV, 20%mtDNA depletion51.2 Open table in a new tab Dissipation of the Membrane Potential Leads to Mitochondrial Fragmentation and to Proteolytic Conversion of Larger into Smaller Isoforms of OPA1—Next we asked whether dissipation of the membrane potential is sufficient to trigger changes in the abundance of OPA1 isoforms and whether this coincides with fragmentation of mitochondria. Indeed, treatment of HeLa cells or fibroblasts with the uncoupler CCCP led to fragmentation of mitochondria (Fig. 4a; data not shown) consistent with earlier reports (23Malka F. Guillery O. Cifuentes-Diaz C. Guillou E. Belenguer P. Lombes A. Rojo M. EMBO Rep. 2005; 6: 853-859Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 25Ishihara N. Jofuku A. Eura Y. Mihara K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 301: 891-898Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar, 26Legros F. Lombes A. Frachon P. Rojo M. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4343-4354Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar). Furthermore, this coincided with a dramatic shift of OPA1 isoforms toward the smaller isoforms (Figs. 3c and 4b). A similar behavior was reported recently in another study performed in parallel (43Ishihara N. Fujita Y. Oka T. Mihara K. EMBO J. 2006; 25: 2966-2977Crossref PubMed Scopus (666) Google Scholar). Processing is specific to OPA1 as other known fusion and fission components such as Mfn2, Drp1, and Fis1 are not processed (Fig. 4c). To test whether the two larger OPA1 isoforms are converted into the smaller ones upon dissipation of the membrane potential, we performed metabolic, radioactive pulse labeling of HeLa cells followed by a chase in the absence or presence of CCCP for 1 h. We could confirm that indeed the two larger OPA1 isoforms (L1- and L2-OPA1) are converted into the smaller ones (S3-, S4-, and S5-OPA1), in particular into S3- and S5-OPA1 (Fig. 4d). This is apparently because of proteolytic cleavage of the larger forms because this process was blocked in the presence of the protease inhibitor o-phenanthroline (Fig. 4e). Processing of OPA1 occurs within mitochondria because all OPA1 isoforms detected remain in the mitochondrial fraction and are not released to the cytosol after subcellular fractionation (Fig. 4f). Furthermore, the smaller isoforms produced could be extracted from mitochondria with detergent-free buffer with a higher efficiency than the larger forms suggesting that the larger forms are integral membrane protein isoforms, and the shorter ones are only peripherally attached to the membrane (Fig. 4g). Other mitochondrial proteins, including three intermembrane space proteins (cytochrome c, AIF, and hMIA40), are not processed supporting further that processing is specific for OPA1 (Fig. 4, f and g). Fragmentation of mitochondria occurred rapidly within 15-30 min after addition of CCCP (Fig. 5, a and b). This is because of a block in mitochondrial fusion as shown earlier (23Malka F. Guillery O. Cifuentes-Diaz C. Guillou E. Belenguer P. Lombes A. Rojo M. EMBO Rep. 2005; 6: 853-859Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 26Legros F. Lombes A. Frachon P. Rojo M. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4343-4354Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar). Processing of OPA1 took place within the same narrow time frame (Fig. 5c). Impairment of fusion of mitochondria may therefore be due to rapid inactivation of OPA1 by proteolysis of larger isoforms. Moreover, upon removal of CCCP, normal mitochondrial morphology was recovered, and this coincided with the reappearance of larger isoforms of OPA1 (Fig. 5, a-c). Mitochondrial fragmentation and OPA1 processing are not accompanied by cytochrome c release in this or in any of the investigated models of mitochondrial dysfunction (Figs. 1a, 2a, and 4e and data not shown). This suggests that mitochondrial fragmentation per se does not result in apoptosis consistent with an earlier report (15Lee Y.J. Jeong S.Y. Karbowski M. Smith C.L. Youle R.J. Mol. Biol. Cell. 2004; 15: 5001-5011Crossref PubMed Scopus (851) Google Scholar).FIGURE 5Proteolytic processing and resynthesis of large OPA1 isoforms parallel dynamic changes of mitochondrial morphology. Cells were treated or not (Control) with CCCP (20 μm) for 30 min, washed, and incubated with medium lacking CCCP for the indicated time periods, or CCCP (20 μm) was left for 6 h. In parallel, these experiments were performed in the presence of CHX (175 μg/ml). Cells were stained with MitoTracker (red), fixed, and immunostained with cytochrome c antibodies (green). a, merged confocal fluorescence images are shown. Top, overview (scale bar, 20 μm); bottom, indicated box (scale bar, 10 μm). b, quantification of mitochondrial morphology as in Fig. 1b. c, OPA1 isoforms in Western blot analysis of total cell extracts. Extracts of untreated cells (C) and of cells treated for 6 h with cycloheximide alone (+CHX 6 h) were used as controls.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Mitochondrial Fragmentation and OPA1 Processing Are Causally Linked—Mitochondrial fragmentation after dissipation of the membrane potential is not dependent on protein synthesis, whereas recovery of mitochondrial fusion after reestablishing a membrane potential is (26Legros F. Lombes A. Frachon P. Rojo M. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4343-4354Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar). We asked whether OPA1 processing and resynthesis of OPA1 isoforms, respectively, could explain these earlier observations. The protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX) did not interfere with fragmentation and OPA1 processing (Fig. 5, a-c). This indicates that fragmentation of mitochondria and activation of OPA1 cleavage are independent of protein synthesis. However, recovery of a tubular mitochondrial network as well as the parallel reappearance of larger OPA1 isoforms was impaired in the presence of CHX (Fig. 5, a-c). Therefore, mitochondrial fragmentation and the shift of OPA1 isoforms are not reversible without ongoing protein synthesis consistent with the explanation that a proteolytic inactivation of OPA1 causes mitochondrial fragmentation. To show the causal and specific role of OPA1 in this process, we decided to check whether OPA1 overexpression can block uncoupler-induced fragmentation. Indeed, fragmentation of mitochondria after CCCP treatment was largely prevented upon overexpression of OPA1 (Fig. 6, a and b). This suggests that OPA1 is directly involved in the fragmentation of mitochondria induced after loss of the mitochondrial membrane potential. A similar effect was observed after the expression of a dominantnegative variant of DRP1 (DRP1K38E) that prevents fission of mitochondria (Fig. 6, a and b). To check whether overexpression of OPA1 or of a dominant-negative variant of DRP1 (DRP1K38E) affects the rate of uncoupler-induced conversion of large OPA1 isoforms into smaller OPA1 isoforms, we performed a pulse-chase experiment. Indeed, overexpression of OPA1 slowed down the processing of OPA1 as indicated by the prolonged presence of L1- and L2-OPA1 when compared with the control overexpression of GFP or of DRP1K38E (Fig. 6c). This effect may even be underestimated also because endogenous OPA1 from about 50% of nontransfected cells contributes to the signal. Thus, additional expression of large isoforms of OPA1 blocks CCCP-induced mitochondrial fragmentation consistent with the proposed fusion-promoting activity of a large but not a short OPA1 isoform (43Ishihara N. Fujita Y. Oka T. Mihara K. EMBO J. 2006; 25: 2966-2977Crossref PubMed Scopus (666) Google Scholar). A dominant-negative variant of DRP1 (DRP1K38E) does not affect the rate of OPA1 processing but blocks mitochondrial fragmentation (Fig. 6, a-c). Thus, the fragmentation that occurs by a block of mitochondrial fusion depends on the normal DRP1-dependent fission pathway. However, processing of OPA1 appears to occur independently from ongoing mitochondrial fission. The processes of mitochondrial damage leading to dysfunction, breakdown of mitochondrial bioenergetic competence, and mitochondrial fragmentation are linked through a cascade of reactions. Here we have identified a central molecular player, namely OPA1, that links changes in mitochondrial morphology with mitochondrial dysfunction. Our conclusions are based on a wide variety of established model systems and patient material exemplary for MERRF, MELAS, mtDNA depletion syndrome, dilated cardiomyopathy, diseases with respiratory deficiencies of unknown origin, and aging. We put forward an hypothesis that describes how this cascade is organized. Mitochondrial dysfunction leads to impairment of bioenergetic competence of mitochondria. This results in reduced membrane potential and ATP production. In such compromised mitochondria, a proteolytic processing of large to small isoforms of OPA1 is activated. As a consequence, fusion of mitochondria is blocked, and due to ongoing mitochondrial fission dysfunctional mitochondria are segregated from the network of intact mitochondria. A key element of the mechanism proposed here is the regulatory inactivation of fusion-promoting OPA1 by proteolytic cleavage. In the case of the homolog of OPA1 in yeast, Mgm1, lack of either of the proteolytically generated large or small isoforms leads to impairment of mitochondrial fusion (35Herlan M. Vogel F. Bornhövd C. Neupert W. Reichert A.S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 27781-27788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (297) Google Scholar, 36Herlan M. Bornhövd C. Hell K. Neupert W. Reichert A.S. J. Cell Biol. 2004; 165: 167-173Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 44Sesaki H. Southard S.M. Hobbs A.E. Jensen R.E. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 308: 276-283Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). We propose that, in a similar way, loss of the two larger isoforms of OPA1 in humans leads to a deficiency in mitochondrial fusion. This is strongly supported by the following observations. 1) OPA1 is required for mitochondrial fusion (27Olichon A. Baricault L. Gas N. Guillou E. Valette A. Belenguer P. Lenaers G. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7743-7746Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (877) Google Scholar, 29Chen H. Chomyn A. Chan D.C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 26185-26192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1008) Google Scholar). 2) Mitochondrial fusion is blocked after treatment with uncoupler in vivo and in vitro (23Malka F. Guillery O. Cifuentes-Diaz C. Guillou E. Belenguer P. Lombes A. Rojo M. EMBO Rep. 2005; 6: 853-859Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 25Ishihara N. Jofuku A. Eura Y. Mihara K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 301: 891-898Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar, 26Legros F. Lombes A. Frachon P. Rojo M. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4343-4354Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar, 43Ishihara N. Fujita Y. Oka T. Mihara K. EMBO J. 2006; 25: 2966-2977Crossref PubMed Scopus (666) Google Scholar, 45Meeusen S.L. Nunnari J. Curr. Opin. Cell Biol. 2005; 17: 389-394Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). 3) Both OPA1 processing after uncoupler treatment as well as resynthesis of OPA1 after removal of uncoupler occur in the same time frame as fragmentation and refusion of mitochondria. 4) Overexpression of OPA1 blocks uncoupler-induced fragmentation of mitochondria and slows down processing of large OPA1 isoforms. 5) In particular, the large isoform of OPA1 but not the short isoform was shown to promote mitochondrial fusion (43Ishihara N. Fujita Y. Oka T. Mihara K. EMBO J. 2006; 25: 2966-2977Crossref PubMed Scopus (666) Google Scholar). In yeast, mitochondrial dysfunction causes a deficiency in the import of the Mgm1 precursor. Consequently, formation of the small isoform and mitochondrial fusion are impaired (36Herlan M. Bornhövd C. Hell K. Neupert W. Reichert A.S. J. Cell Biol. 2004; 165: 167-173Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar). In humans, mitochondrial dysfunction is sensed in a different fashion, which is independent of protein synthesis and consequently protein import into mitochondria. Still, this leads to the specific, rapid, and intramitochondrial inactivation of the orthologous effector protein, OPA1. We propose that this fast and sensitive molecular mechanism that connects mitochondrial functionality and morphology separates dysfunctional from functional mitochondria. This serves mainly two purposes highly relevant to the progression of mitochondrial diseases and neurodegenerative disorders. First, it would reduce further damaging of mtDNA by reactive oxygen species by the spatial separation of damaged mitochondria from the intact tubular network. Second, it would enable the removal of dysfunctional mitochondria by autophagy or more specifically mitophagy. In principle, mitophagy was shown to be increased in some systems of mitochondrial dysfunction (46Priault M. Salin B. Schaeffer J. di Vallette F.M. Rago J.P. Martinou J.C. Cell Death Differ. 2005; 12: 1613-1621Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 48Skulachev V.P. Bakeeva L.E. Chernyak B.V. Domnina L.V. Minin A.A. Pletjushkina O.Y. Saprunova V.B. Skulachev I.V. Tsyplenkova V.G. Vasiliev J.M. Yaguzhinsky L.S. Zorov D.B. Mol. Cell. Biochem. 2004; 256: 341-358Crossref PubMed Google Scholar). OPA1-dependent counter-selection of damaged mitochondria is an intracellular process that does not depend on cell division-based selection. It is therefore of particular importance in the aging process and in post-mitotic tissues. Indeed, predominantly these tissues are affected in myopathies and neurodegenerative disorders caused by mitochondrial dysfunction. Interestingly, mutations in OPA1 are known to be causative to hereditary optic atrophy type 1 (10Alexander C. Votruba M. Pesch U.E. Thiselton D.L. Mayer S. Moore A. Rodriguez M. Kellner U. Leo-Kottler B. Auburger G. Bhattacharya S.S. Wissinger B. Nat. Genet. 2000; 26: 211-215Crossref PubMed Scopus (1056) Google Scholar, 11Delettre C. Lenaers G. Griffoin J.M. Gigarel N. Lorenzo C. Belenguer P. Pelloquin L. Grosgeorge J. Turc-Carel C. Perret E. Astarie-Dequeker C. Lasquellec L. Arnaud B. Ducommun B. Kaplan J. Hamel C.P. Nat. Genet. 2000; 26: 207-210Crossref PubMed Scopus (1149) Google Scholar). Therefore, impairment of OPA1 function may result in impaired separation of damaged mitochondria contributing to the pathomechanism of this neurodegenerative disorder. This, however, does not exclude that impairment of mitochondrial fusion leads to a reduced mitochondrial membrane potential, low respiration rate, slow cell growth, and increased susceptibility to apoptosis by other mechanisms as proposed earlier (29Chen H. Chomyn A. Chan D.C. J. Biol. Chem. 2005; 280: 26185-26192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1008) Google Scholar). We thank Drs. Luca Scorrano and Heidi McBride for plasmids, Prof. Antonio Zorzano for antibodies, Iris Haag for technical assistance, and Drs. Juan Alfonzo and Doron Rapaport for comments on the manuscript.

Mitochondrial dysfunction is linked to apoptosis, aging, cancer, and a number of neurodegenerative and muscular disorders. The interplay between mitophagy and mitochondrial dynamics has been linked to the removal of dysfunctional mitochondria ensuring mitochondrial quality control. An open question is what role mitochondrial fission plays in the removal of mitochondria after mild and transient oxidative stress; conditions reported to result in moderately elevated reactive oxygen species (ROS) levels comparable to physical activity. Here we show that applying such conditions led to fragmentation of mitochondria and induction of mitophagy in mouse and human cells. These conditions increased ROS levels only slightly and neither triggered cell death nor led to a detectable induction of non-selective autophagy. Starvation led to hyperfusion of mitochondria, to high ROS levels, and to the induction of both non-selective autophagy and to a lesser extent to mitophagy. We conclude that moderate levels of ROS specifically trigger mitophagy but are insufficient to trigger non-selective autophagy. Expression of a dominant-negative variant of the fission factor DRP1 blocked mitophagy induction by mild oxidative stress as well as by starvation. Taken together, we demonstrate that in mammalian cells under mild oxidative stress a DRP1-dependent type of mitophagy is triggered while a concomitant induction of non-selective autophagy was not observed. We propose that these mild oxidative conditions resembling well physiological situations are thus very helpful for studying the molecular pathways governing the selective removal of dysfunctional mitochondria.

The inner membrane of mitochondria is organized in two morphologically distinct domains, the inner boundary membrane (IBM) and the cristae membrane (CM), which are connected by narrow, tubular cristae junctions. The protein composition of these domains, their dynamics, and their biogenesis and maintenance are poorly understood at the molecular level. We have used quantitative immunoelectron microscopy to determine the distribution of a collection of representative proteins in yeast mitochondria belonging to seven major processes: oxidative phosphorylation, protein translocation, metabolite exchange, mitochondrial morphology, protein translation, iron-sulfur biogenesis, and protein degradation. We show that proteins are distributed in an uneven, yet not exclusive, manner between IBM and CM. The individual distributions reflect the physiological functions of proteins. Moreover, proteins can redistribute between the domains upon changes of the physiological state of the cell. Impairing assembly of complex III affects the distribution of partially assembled subunits. We propose a model for the generation of this dynamic subcompartmentalization of the mitochondrial inner membrane.

The structure of mitochondria is highly dynamic and depends on the balance of fusion and fission processes. Deletion of the mitochondrial dynamin-like protein Mgm1 in yeast leads to extensive fragmentation of mitochondria and loss of mitochondrial DNA. Mgm1 and its human ortholog OPA1, associated with optic atrophy type I in humans, were proposed to be involved in fission or fusion of mitochondria or, alternatively, in remodeling of the mitochondrial inner membrane and cristae formation (Wong, E. D., Wagner, J. A., Gorsich, S. W., McCaffery, J. M., Shaw, J. M., and Nunnari, J. (2000) J. Cell Biol. 151, 341-352; Wong, E. D., Wagner, J. A., Scott, S. V., Okreglak, V., Holewinske, T. J., Cassidy-Stone, A., and Nunnari, J. (2003) J. Cell Biol. 160, 303-311; Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., and Jensen, R. E. (2003) Mol. Biol. Cell, in press). Mgm1 and its orthologs exist in two forms of different lengths. To obtain new insights into their biogenesis and function, we have characterized these isoforms. The large isoform (l-Mgm1) contains an N-terminal putative transmembrane segment that is absent in the short isoform (s-Mgm1). The large isoform is an integral inner membrane protein facing the intermembrane space. Furthermore, the conversion of l-Mgm1 into s-Mgm1 was found to be dependent on Pcp1 (Mdm37/YGR101w) a recently identified component essential for wild type mitochondrial morphology. Pcp1 is a homolog of Rhomboid, a serine protease known to be involved in intercellular signaling in Drosophila melanogaster, suggesting a function of Pcp1 in the proteolytic maturation process of Mgm1. Expression of s-Mgm1 can partially complement the Deltapcp1 phenotype. Expression of both isoforms but not of either isoform alone was able to partially complement the Deltamgm1 phenotype. Therefore, processing of l-Mgm1 by Pcp1 and the presence of both isoforms of Mgm1 appear crucial for wild type mitochondrial morphology and maintenance of mitochondrial DNA.

Loss-of-function mutations in the parkin gene (PARK2) and PINK1 gene (PARK6) are associated with autosomal recessive parkinsonism. PINK1 deficiency was recently linked to mitochondrial pathology in human cells and Drosophila melanogaster, which can be rescued by parkin, suggesting that both genes play a role in maintaining mitochondrial integrity. Here we demonstrate that an acute down-regulation of parkin in human SH-SY5Y cells severely affects mitochondrial morphology and function, a phenotype comparable with that induced by PINK1 deficiency. Alterations in both mitochondrial morphology and ATP production caused by either parkin or PINK1 loss of function could be rescued by the mitochondrial fusion proteins Mfn2 and OPA1 or by a dominant negative mutant of the fission protein Drp1. Both parkin and PINK1 were able to suppress mitochondrial fragmentation induced by Drp1. Moreover, in Drp1-deficient cells the parkin/PINK1 knockdown phenotype did not occur, indicating that mitochondrial alterations observed in parkin- or PINK1-deficient cells are associated with an increase in mitochondrial fission. Notably, mitochondrial fragmentation is an early phenomenon upon PINK1/parkin silencing that also occurs in primary mouse neurons and Drosophila S2 cells. We propose that the discrepant findings in adult flies can be explained by the time of phenotype analysis and suggest that in mammals different strategies may have evolved to cope with dysfunctional mitochondria.

Background Parkinson's disease (PD) is an adult-onset movement disorder of largely unknown etiology. We have previously shown that loss-of-function mutations of the mitochondrial protein kinase PINK1 (PTEN induced putative kinase 1) cause the recessive PARK6 variant of PD. Methodology/Principal Findings Now we generated a PINK1 deficient mouse and observed several novel phenotypes: A progressive reduction of weight and of locomotor activity selectively for spontaneous movements occurred at old age. As in PD, abnormal dopamine levels in the aged nigrostriatal projection accompanied the reduced movements. Possibly in line with the PARK6 syndrome but in contrast to sporadic PD, a reduced lifespan, dysfunction of brainstem and sympathetic nerves, visible aggregates of α-synuclein within Lewy bodies or nigrostriatal neurodegeneration were not present in aged PINK1-deficient mice. However, we demonstrate PINK1 mutant mice to exhibit a progressive reduction in mitochondrial preprotein import correlating with defects of core mitochondrial functions like ATP-generation and respiration. In contrast to the strong effect of PINK1 on mitochondrial dynamics in Drosophila melanogaster and in spite of reduced expression of fission factor Mtp18, we show reduced fission and increased aggregation of mitochondria only under stress in PINK1-deficient mouse neurons. Conclusion Thus, aging Pink1−/− mice show increasing mitochondrial dysfunction resulting in impaired neural activity similar to PD, in absence of overt neuronal death.

Aims: Intracellular amyloid beta (Aβ) oligomers and extracellular Aβ plaques are key players in the progression of sporadic Alzheimer's disease (AD). Still, the molecular signals triggering Aβ production are largely unclear. We asked whether mitochondrion-derived reactive oxygen species (ROS) are sufficient to increase Aβ generation and thereby initiate a vicious cycle further impairing mitochondrial function. Results: Complex I and III dysfunction was induced in a cell model using the respiratory inhibitors rotenone and antimycin, resulting in mitochondrial dysfunction and enhanced ROS levels. Both treatments lead to elevated levels of Aβ. Presence of an antioxidant rescued mitochondrial function and reduced formation of Aβ, demonstrating that the observed effects depended on ROS. Conversely, cells overproducing Aβ showed impairment of mitochondrial function such as comprised mitochondrial respiration, strongly altered morphology, and reduced intracellular mobility of mitochondria. Again, the capability of these cells to generate Aβ was partly reduced by an antioxidant, indicating that Aβ formation was also ROS dependent. Moreover, mice with a genetic defect in complex I, or AD mice treated with a complex I inhibitor, showed enhanced Aβ levels in vivo. Innovation: We show for the first time that mitochondrion-derived ROS are sufficient to trigger Aβ production in vitro and in vivo. Conclusion: Several lines of evidence show that mitochondrion-derived ROS result in enhanced amyloidogenic amyloid precursor protein processing, and that Aβ itself leads to mitochondrial dysfunction and increased ROS levels. We propose that starting from mitochondrial dysfunction a vicious cycle is triggered that contributes to the pathogenesis of sporadic AD. Antioxid. Redox Signal. 16, 1421–1433.

Crista junctions (CJs) are important for mitochondrial organization and function, but the molecular basis of their formation and architecture is obscure. We have identified and characterized a mitochondrial membrane protein in yeast, Fcj1 (formation of CJ protein 1), which is specifically enriched in CJs. Cells lacking Fcj1 lack CJs, exhibit concentric stacks of inner membrane in the mitochondrial matrix, and show increased levels of F1FO–ATP synthase (F1FO) supercomplexes. Overexpression of Fcj1 leads to increased CJ formation, branching of cristae, enlargement of CJ diameter, and reduced levels of F1FO supercomplexes. Impairment of F1FO oligomer formation by deletion of its subunits e/g (Su e/g) causes CJ diameter enlargement and reduction of cristae tip numbers and promotes cristae branching. Fcj1 and Su e/g genetically interact. We propose a model in which the antagonism between Fcj1 and Su e/g locally modulates the F1FO oligomeric state, thereby controlling membrane curvature of cristae to generate CJs and cristae tips.