Abstract Ebola virus (EBOV) is the most virulent pathogens that cause hemorrhagic fever with high mortality rates in humans and nonhuman primates. The postexposure antibody therapies to prevent EBOV infection are considered efficient. However, due to the poor thermal stability of mammalian antibody, their application in the tropics has been limited. Here, we developed a thermostable therapeutic antibody against EBOV based on chicken immunoglobulin Y (IgY). The IgY antibodies demonstrated excellent thermal stability, which retained their neutralizing activity at 25°C for one year, in contrast to conventional polyclonal or monoclonal antibodies (MAbs). We immunized laying hens with a variety of EBOV vaccine candidates and confirmed that VSV Δ G/EBOVGP encoding the EBOV glycoprotein could induce high titer neutralizing antibodies against EBOV. The therapeutic efficacy of immune IgY antibodies in vivo was evaluated in the newborn Balb/c mice model. Lethal dose of virus challenged mice were treated 2 or 24 h post-infection with different doses of anti-EBOV IgY. The group receiving a high dose of 10 6 NAU/kg (neutralizing antibody units/kilogram) achieved complete protection with no signs of disease, while the low-dose group was only partially protected. In contrast, all mice receiving naïve IgY died within 10 days. In conclusion, the anti-EBOV IgY exhibits excellent thermostability and protective efficacy, and it is very promising to be developed as alternative therapeutic entities. Author Summary Although several Ebola virus therapeutic antibodies have been reported in recent years, however, due to the poor thermal stability of mammalian antibody, their application in tropical endemic areas has been limited. We developed a highly thermostable therapeutic antibody against EBOV based on chicken immunoglobulin Y (IgY). The IgY antibodies demonstrated excellent thermal stability, which retained their neutralizing activity at 25°C for one year. The newborn mice receiving passive transfer of IgY achieved complete protection against a lethal dose of virus challenge indicating that the anti-EBOV IgY provides a promising countermeasure to solve the current clinical application problems of Ebola antibody-based treatments in Africa.

Abstract Mitochondrial stress and dysfunction play important roles in many pathologies. However, how cells respond to mitochondrial stress is not fully understood. Here, we examined the translational response to electron transport chain (ETC) inhibition and arsenite induced mitochondrial stresses. Our analysis revealed that during mitochondrial stress, tRNA modifications (namely f5C, hm5C, queuosine and its derivatives, and mcm5U) dynamically change to fine tune codon decoding, usage, and optimality. These changes in codon optimality drive the translation of many pathways and gene sets, such as the ATF4 pathway and selenoproteins, involved in the cellular response to mitochondrial stress. We further examined several of these modifications using targeted approaches. ALKBH1 knockout (KO) abrogated f5C and hm5C levels and led to mitochondrial dysfunction, reduced proliferation, and impacted mRNA translation rates. Our analysis revealed that tRNA queuosine (tRNA-Q) is a master regulator of the mitochondrial stress response. KO of QTRT1 or QTRT2, the enzymes responsible for tRNA-Q synthesis, led to mitochondrial dysfunction, translational dysregulation, and metabolic alterations in mitochondria-related pathways, without altering cellular proliferation. In addition, our analysis revealed that tRNA-Q loss led to a domino effect on various tRNA modifications. Some of these changes could be explained by metabolic profiling. Our analysis also revealed that utilizing serum deprivation or alteration with Queuine supplementation to study tRNA-Q or stress response can introduce various confounding factors by altering many other tRNA modifications. In summary, our data show that tRNA modifications are master regulators of the mitochondrial stress response by driving changes in codon decoding.

Abstract Cleavage of gasdermin, typically by caspase (CASP), is required for pyroptosis. In human, CASP3 and CASP7 recognize the same consensus motif DxxD, which is present in gasdermin E (GSDME), but only CASP3 cleaves GSDME. The underlying mechanism of this observation is unclear. In this study, we identified a pyroptotic pufferfish GSDME that was specifically cleaved by both pufferfish CASP3/7 and human CASP3/7. Domain swapping between pufferfish and human CASP/GSDME showed that the GSDME C-terminus and the CASP7 p10 subunit determined the cleavability of GSDME by CASP7. p10 contains a key residue that governs CASP7 substrate discrimination. This residue is highly conserved in vertebrate CASP3 and in most vertebrate (except mammalian) CASP7. In mammals, the key residue is conserved in non-primate (e.g., mouse) but not in primate. However, mouse CASP7 cleaved human GSDME but not mouse GSDME. These findings revealed the molecular mechanism of CASP7 substrate discrimination that underlies the evolutionary divergence of CASP3/7-mediated GSDME activation in vertebrate.

Abstract Rationale Moyamoya disease (MMD) is a rare cerebrovascular occlusive disease that affects Asian population more often. The pathogenesis of MMD is related to mutation in RNF213 gene. However, why, and how RNF213 mutation leads to MMD is still not fully understood. Objective Analyze the impact of RNF213 loss of function on vascular cells and the observed changes correlate with MMD. Methods and results RNF213 KD was conducted in HUVEC and vascular smooth muscle cells (vSMCs). First, HUVEC cells showed alteration of angiogenesis, migration under LPS stimulation, Leukocyte endothelial transmigration, and endothelial-to-vSMCs communication. Transcriptome analysis revealed downregulation of genes regulating cell division and mitosis. Interestingly, Alternative splicing (AS) analysis revealed hundreds of AS events to occur after RNF213 KD in various types of AS. The alternatively spliced genes showed minimal overlap with transcriptome profiling. Pathway analysis revealed many processes and pathways to be regulated by AS events observed. Transcriptome profiling was also performed after LPS treatment and revealed the basis for increased sensitivity to LPS observed in our analysis. AS changes were also observed after LPS treatment in RNF213 KD HUVEC. Different types of AS showed different patterns of convergence or divergence in terms of the regulated pathways after LPS treatment. Finally, transcriptome and AS analysis was performed in vSMCs and showed various processes that impact vSMCs function and phenotype in RNF213 loss of function. Conclusion Our data provide a wealth of information on RNF213 gene function in vascular tissues and shed important light on different processes that contribute to MMD pathogenesis. Our results signify an immune-driven and hemodynamically linked process of MMD initiation and progression.

Abstract Ferroptosis is a non-apoptotic cell death mechanism characterized by the production of lipid peroxides. Ferroptosis plays important roles in many diseases such as cancer and neurodegenerative diseases. While many effectors in the ferroptosis pathway have been mapped, its epigenetic and epitranscriptional regulatory processes are not yet fully understood. Ferroptosis can be induced via system xCT inhibition (Class I) or GPX4 inhibition (Class II). Previous works have revealed important differences in cellular response to Class I and Class II ferroptosis inducers. Importantly, blocking mRNA transcription or translation appears to protect cells against Class I ferroptosis inducing agents but not Class II. Understanding these subtle differences is important in understanding ferroptosis as well as in developing therapeutics based on ferroptosis for various diseases. In this work, we examined the impact of blocking transcription (via Actinomycin D) or translation (via Cycloheximide) on Erastin (Class I) or RSL3 (Class II) induced ferroptosis. Blocking transcription or translation protected cells against Erastin but was detrimental against RSL3. Cycloheximide led to increased levels of GSH alone or when co-treated with Erastin and the activation of the reverse transsulfuration pathway. RNA sequencing analysis revealed an important and unexplored role of Alternative splicing (AS) in regulating ferroptosis stress response and mRNA translation repression. Our results indicated that translation repression is protective against Erastin but detrimental against RSL3. We tested this theory in Alkbh1 overexpressing glioma cells. Alkbh1 demethylates tRNA and represses translation and is associated with worse outcome in glioma patients. Our results showed that Alkbh1 overexpression protected glioma cells against Erastin but was detrimental against RSL3.

The steady state levels of mRNA are outcomes of a finely tuned interplay between RNA transcription and decay. Therefore, the modulation of RNA stability is generally assumed to influence RNA abundance in a positive direction. However, the correlation between mRNA transcription, translation and stability remains elusive. Here, we employed a newly developed simplified mRNA stability profiling technique to explore the role of mRNA stability in SH-SY5Y neuronal differentiation model. Transcriptome-wide mRNA stability analysis revealed neural-specific RNA stability kinetics, including stabilization of transcripts encoding regulators of neuronal morphogenesis and function and destabilization of mitochondrial electron transport and redox homeostasis. When we further examined the relationship between transcription, translation and mRNA stability, a bidirectional regulation of RNA stability was revealed, wherein mRNA stability could either exert the buffering effect on gene products or change in a same direction as transcription. Motif analysis unveiled SAMD4A as a major regulator of the dynamic changes in mRNA stability observed during differentiation. Knockdown of SAMD4A impaired neuronal differentiation and influenced the response to oxidative stress. Mechanistically, SAMD4A was found to alter the stability of several mRNAs to which it binds. Meanwhile, a dimorphic pattern of the correlation between gene expression and SAMD4A-regulated mRNA stability was observed, suggesting dynamic regulation mRNA stability during the neuronal differentiation guided by SAMD4A. The novel insights into the interplay between mRNA stability and cellular behaviors provide a foundation for understanding neurodevelopmental processes and neurodegenerative disorders and highlights dynamic mRNA stability as an important layer of gene expression regulation.

Abstract Neuronal differentiation is a complex process that entails extensive morphological, transcriptional, metabolic, and functional changes that dictate neuronal lineage commitment. Much less understood is the role that epigenetic and epi-transcriptional reprogramming plays in the process of neuronal differentiation and maturation. To depict the whole landscape of transcriptomics and epigenetic changes during neuronal differentiation and maturation, we differentiated SH-SY5Y cells and performed RNA sequencing on differentiated and undifferentiated cells. 728 differentially expressed genes (DEGs) enriched in synaptic signaling and cell morphogenesis pathways were observed. Moreover, transcriptome-wide mRNA stability profiling revealed that genes with altered stability were exceptionally enriched for redox homeostasis pathways. Mature neurons are known to be highly sensitive to oxidative stress, which is crucial in the pathophysiology of neurodegenerative disease. Our results suggest that this heightened sensitivity is regulated at the mRNA stability level (i.e., epigenetic) rather than at the transcriptional level. Alternative splicing analysis revealed the exon skipping and alternative mRNA isoforms enriched for morphogenesis related pathway. Alternatively, alternative 5 and 3 prime splicing site, intron retention and mutually exclusive exon events exclusively clustered in the translation and translation initiation pathways, suggesting the potential effect of alternative splicing on translation following neuronal maturation. Splice motif analysis revealed enriched motifs for RBPs that regulate various splice types and can be further correlated to distinct phenotypical changes during neuronal differentiation and maturation. Here we present an extensive exploration of the transcriptional and epigenetic changes and their potential association with the process of neuronal differentiation, providing a new insight into understanding the molecular mechanism of neuronal function and behavior.

Abstract Vestimentiferans (Siboglinidae, Polychaeta) thrive in deep-sea hydrothermal vents and depend on chemosynthetic symbiosis for nutrition. Currently, the central carbon metabolisms, especially the sugar synthesis pathways, of vestimentiferans remain obscure. In this study, the genome of the vestimentiferan Arcovestia ivanovi was obtained. Comparative genomics revealed that, unlike other Polychaeta, vestimentiferans possessed trehaloneogenesis and lacked gluconeogenesis. Transcriptome and metabolome detected the expression of trehalose-6-phosphate synthase (TPS), the key enzyme of trehaloneogenesis, and trehalose in vestimentiferan tissues, especially trophosome, suggesting the possibility of trehalose as the main blood sugar in vestimentiferans. Vestimentiferan TPS was most closely related to arthropod TPS and may be transferred from arthropods via transposons that existed in high densities around the vestimentiferan and arthropod TPS loci. Electron microscopy observed vestimentiferan symbionts with packed glycogen granules. Consistently, glycogen biosynthesis was present in vestimentiferan symbionts but absent in other Siboglinidae symbionts. Together this study revealed that vestimentiferans have evolved unique metabolic mechanisms to adapt to hydrothermal vents by utilizing trehaloneogenesis as the major sugar-synthesizing pathway, which produces trehalose to facilitate tolerance of the stresses (such as high temperature and H 2 S) of the vents. This study also indicated a critical role of bacterial glycogen biosynthesis in the highly efficient symbiont-vestimentiferan cooperation.