Cell migration requires the generation of branched actin networks that power the protrusion of the plasma membrane in lamellipodia. The actin-related proteins 2 and 3 (Arp2/3) complex is the molecular machine that nucleates these branched actin networks. This machine is activated at the leading edge of migrating cells by Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP)-family verprolin-homologous protein (WAVE, also known as SCAR). The WAVE complex is itself directly activated by the small GTPase Rac, which induces lamellipodia. However, how cells regulate the directionality of migration is poorly understood. Here we identify a new protein, Arpin, that inhibits the Arp2/3 complex in vitro, and show that Rac signalling recruits and activates Arpin at the lamellipodial tip, like WAVE. Consistently, after depletion of the inhibitory Arpin, lamellipodia protrude faster and cells migrate faster. A major role of this inhibitory circuit, however, is to control directional persistence of migration. Indeed, Arpin depletion in both mammalian cells and Dictyostelium discoideum amoeba resulted in straighter trajectories, whereas Arpin microinjection in fish keratocytes, one of the most persistent systems of cell migration, induced these cells to turn. The coexistence of the Rac-Arpin-Arp2/3 inhibitory circuit with the Rac-WAVE-Arp2/3 activatory circuit can account for this conserved role of Arpin in steering cell migration.

Abstract BRCA2 plays a prominent role in meiotic homologous recombination (HR). Loss of BRCA2 or several of its meiotic partners causes fertility defects. One of these partners, HSF2BP, was recently discovered as expressed physiologically in germline and ectopically produced in cancer cells. It has an N-terminal coiled coil motif involved in direct binding to the protein BRME1, and both HSF2BP and BRME1 are essential for meiotic HR during spermatogenesis. It also interacts through its C-terminal Armadillo (ARM) domain with a conserved region of BRCA2 of unknown function. We analyzed the structural properties and functional consequences of the BRCA2-HSF2BP interaction and tested the emerging model of its involvement in meiosis. We solved the crystal structure of the complex between the BRCA2 fragment that is disordered in solution and the HSF2BP dimeric ARM domain. This revealed two previously unrecognized BRCA2 repeats that each interact with one ARM monomer from two different dimers. BRCA2 binding triggers ARM tetramerization, resulting in a complex containing two BRCA2 fragments connecting two ARM dimers. The 3D structures of the BRCA2 repeats are superimposable, revealing conserved contacts between the BRCA2 residues defining the repeats and the HSF2BP residues lining the groove of the ARM. This large interface is responsible for the nanomolar affinity of the interaction, significantly stronger than any other measured interaction involving BRCA2. Deleting exon 12 from Brca2 , encoding the first repeat, disrupted BRCA2 binding to HSF2BP in vitro and in cells. However, Brca2 Δ12/Δ12 mice with the same deletion were fertile and did not show any meiotic defects, contrary to the prediction from the model positing that HSF2BP acts as a meiotic localizer of BRCA2. We conclude that the high-affinity interaction between BRCA2 and HSF2BP and the resulting HSF2BP oligomerization are not required for RAD51 and DMC1 recombinase localization to meiotic double strand breaks and for productive meiotic HR.

Abstract In vertebrates, the BRCA2 protein is essential for meiotic and somatic homologous recombination (HR) due to its interaction with RAD51 and DMC1 strand exchange proteins (recombinases). The interaction is mediated by FxxA and FxPP motifs, whose defining feature is the invariant phenylalanine. The FxxA motifs, present in the eight BRC repeats in the central region of BRCA2, compete with the FxxA motif of the linker region of RAD51 that is responsible for recombinase self-oligomerization. In vitro, BRCs disrupt RAD51 nucleoprotein filaments, but they are essential for RAD51 function in the context of the full-length BRCA2 protein. The role of the FxPP motifs is poorly studied but they also contribute to BRCA2 function in cells. In particular, the C-terminal TR2/CTRB domain of BRCA2, which contains an FxPP motif, is required for stabilization of RAD51 filament and replication fork protection. We recently found that deletion of the BRCA2 PhePP domain, which contains another FxPP motif, disrupts DMC1 but not RAD51 function in meiosis. Here we provide a mechanistic explanation for this phenotype by solving the crystal structure of the complex between DMC1 and the PhePP domain of BRCA2. Our structure reveals that, despite sequence similarity, the A-motifs (FxxA) and P-motifs (FxPP) bind to distinct and contiguous sites on the recombinases. The PhePP P-motif binding site is mostly located at the ATPase domain surface of a DMC1 monomer, but also extends to the linker region of the adjacent monomer, thus engaging two adjacent protomers in the DMC1 oligomer. Our structural analysis provides a mechanism explaining how PhePP favors the formation of the DMC1 nucleoprotein filament and stabilizes it. It corroborates and explains the stabilizing effect of the P-motif from BRCA2 TR2/CTRB on RAD51.

Abstract In vertebrates, the BRCA2 protein is essential for meiotic and somatic homologous recombination due to its interaction with the RAD51 and DMC1 recombinases through FxxA and FxPP motifs (here named A- and P-motifs, respectively). The A-motifs present in the eight BRC repeats of BRCA2 compete with the A-motif of RAD51, which is responsible for its self-oligomerization. BRCs thus disrupt RAD51 nucleoprotein filaments in vitro. The role of the P-motifs is less studied. We recently found that deletion of Brca2 exons 12–14 encoding one of them (the prototypical ‘PhePP’ motif), disrupts DMC1 but not RAD51 function in mouse meiosis. Here we provide a mechanistic explanation for this phenotype by solving the crystal structure of the complex between a BRCA2 fragment containing the PhePP motif and DMC1. Our structure reveals that, despite sharing a conserved phenylalanine, the A- and P-motifs bind to distinct sites on the ATPase domain of the recombinases. The P-motif interacts with a site that is accessible in DMC1 octamers and nucleoprotein filaments. Moreover, we show that this interaction also involves the adjacent protomer and thus increases the stability of the DMC1 nucleoprotein filaments. We extend our analysis to other P-motifs from RAD51AP1 and FIGNL1.

Abstract DNA double strand breaks (DSBs) are deleterious lesions that challenge genome integrity. To mitigate this threat, human cells rely on the activity of multiple DNA repair machineries that are tightly regulated throughout the cell cycle 1 . In interphase, DSBs are mainly repaired by non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) 2 . However, these pathways are completely inhibited in mitosis 3–5 , leaving the fate of mitotic DSBs unknown. Here we show that DNA polymerase theta (Polθ) 6 repairs mitotic DSBs and thereby maintains genome integrity. In contrast to other DSB repair factors, Polθ function is activated in mitosis upon phosphorylation by the Polo-like kinase 1 (PLK1). Phosphorylated Polθ is recruited to mitotic DSBs, where it mediates joining of broken DNA ends, while halting mitotic progression. The lack of Polθ leads to a shortening of mitotic duration and defective repair of mitotic DSBs, resulting in a loss of genome integrity. In addition, we identify mitotic Polθ repair as the underlying cause of the synthetic lethality between Polθ and HR. Our findings reveal the critical importance of mitotic DSB repair for maintaining genome stability.

ABSTRACT In meiotic homologous recombination (HR), BRCA2 facilitates loading of the recombinases RAD51 and DMC1 at the sites of double-strand breaks. The HSF2BP-BRME1 complex interacts with BRCA2 to support its function in meiotic HR. In somatic cancer cells ectopically producing HSF2BP, DNA damage can trigger HSF2BP-dependent degradation of BRCA2, which prevents HR. Here we show that, upon binding to BRCA2, HSF2BP assembles into a large ring-shaped 24-mer consisting of three interlocked octameric rings. Addition of BRME1 leads to dissociation of this ring structure, and cancels the disruptive effect of HSF2BP on cancer cell resistance to DNA damage. It also prevents BRCA2 degradation during inter-strand DNA crosslink repair in Xenopus egg extracts. We propose that the control of HSF2BP-BRCA2 oligomerization by BRME1 ensures timely assembly of the ring complex that concentrates BRCA2 and controls its turnover, thus promoting meiotic HR.

Abstract Phage therapy has recently regained attention at combating multidrug-resistant bacteria. In 2019, tailed bacteriophages of the Siphoviridae family were engineered to successfully treat a disseminated bacterial infection after all other drugs had failed.( 1 ) This family of phages features a long, flexible, non-contractile tail that has been difficult to characterize structurally. Here, we present the atomic structure of the tail-tube of the bacteriophage SPP1 – a member of this family. Our hybrid structure is based on the integration of structural restraints from solid-state NMR and a density map from cryo-EM. We show that the tail tube protein (TTP) gp17.1 organizes into hexameric rings that are stacked by flexible linker domains and, thus, form a hollow flexible tube with a negatively charged lumen suitable for the transport of DNA. One sentence summary Integrative structural biology by solid-state NMR and cryo-EM enables structure determination of the flexible tail of the bacteriophage SPP1.

ABSTRACT Rhoptries and micronemes are essential for host cell invasion and survival of all apicomplexan parasites, which are composed of numerous obligate intracellular protozoan pathogens including Plasmodium falciparum (malaria) and Toxoplasma gondii (toxoplasmosis) that infect humans and animals causing severe diseases. We identified Toxoplasma gondii TgSORT as an essential cargo receptor, which drives the transport of rhoptry (ROP) and microneme (MIC) proteins to ensure the biogenesis of these secretory organelles. The luminal ectodomain of 752 amino acid long situated at the N-terminus end of TgSORT has been described to bind to MIC and ROP proteins. Here, we present an optimized protocol for expression of the entire luminal ectodomain of TgSORT (Tg-NSORT) in the yeast Pichia pastoris. Optimization of its coding sequence, cloning and transformation of the yeast P. pastoris allowed the secretion of Tg-NSORT. The protein was purified and further analyzed by negative staining electron microscopy. In addition, molecular modeling using AlphaFold identified key differences between human and T gondii sortilin. The structural features that are only present in T. gondii and other apicomplexan parasites were highlighted. Elucidating the roles of these specific structural features may be useful for designing new therapeutic agents against apicomplexan parasites

The BRCA2 tumor suppressor protein is involved in the maintenance of genome integrity through its role in homologous recombination. In mitosis, BRCA2 is phosphorylated by Polo-like kinase 1 (PLK1). Here we describe how this phosphorylation contributes to the control of mitosis. We identified two highly conserved phosphorylation sites at S193 and T207 of BRCA2. Phosphorylated-T207 is a bona fide docking site for PLK1 as illustrated by the crystal structure of the BRCA2 peptide bound to PLK1 Polo-box domain. We found that BRCA2 bound to PLK1 forms a complex with the phosphatase PP2A and phosphorylated-BUBR1. Reducing BRCA2 binding to PLK1, as observed in BRCA2 breast cancer variants S206C and T207A, alters the tetrameric complex resulting in misaligned chromosomes, faulty chromosome segregation and aneuploidy. We thus reveal a direct role of BRCA2 in the alignment of chromosomes, distinct from its DNA repair function, with important consequences on chromosome stability. These findings may explain in part the aneuploidy observed in BRCA2 -mutated tumors.

ABSTRACT BRCA2 has multiple functional domains that interact with different partners, and is essential for both somatic and meiotic homologous recombination (HR). We created a Brca2 Δ12-14 mouse model with an internal deletion of the region which we named “the meiotic domain of BRCA2”, as its loss results in complete failure of meiotic HR, while somatic HR is intact. The deletion in the protein includes the HSF2BP-binding motifs (exons 12-13) and the DMC1-binding PhePP domain (exon 14). Brca2 Δ12-14 mice showed complete infertility in both males and females, with sexually dimorphic features. Recombinase foci (both RAD51 and DMC1) were completely undetectable in mutant spermatocytes, but while DMC1 foci were also absent in mutant oocytes, RAD51 foci numbers were only partially reduced (up to 60% fewer, 20% less intense). The relevance of the PhePP domain for meiotic HR has been controversial, but both the phenotype of Brca2 Δ12-14 , and our biochemical data indicate that, along with the BRC repeats of BRCA2, PhePP is both essential and specific for DMC1 loading in meiotic HR, analogous to the C-terminal RAD51-specific TR2/CTRB. Further investigation of DSB end processing in Brca2 Δ12-14 meiocytes and controls, using super-resolution imaging of RPA and SYCP3 led to discovery of two novel features. First, in Brca2 Δ12-14 oocytes, but not in the spermatocytes nor wild types, we observed RPA foci as doublets ∼200 nm apart, which could represent DSB end separation. Second, we describe RPA structures that are completely HR-dependent and are indicative of long, double-stranded DNA connections between homologs prior to synapsis. The observations led us to a model for chromosome alignment via multiple, tensed DNA tethers that connect the homologous DNA regions. We propose that in combination with dynamic adjustment of chromatin loops by meiotic cohesins, this is a plausible molecular mechanism to bring the homologs closer and initiate synapsis.