Legume plants host nitrogen-fixing endosymbiotic Rhizobium bacteria in root nodules. In Medicago truncatula, the bacteria undergo an irreversible (terminal) differentiation mediated by hitherto unidentified plant factors. We demonstrated that these factors are nodule-specific cysteine-rich (NCR) peptides that are targeted to the bacteria and enter the bacterial membrane and cytosol. Obstruction of NCR transport in the dnf1-1 signal peptidase mutant correlated with the absence of terminal bacterial differentiation. On the contrary, ectopic expression of NCRs in legumes devoid of NCRs or challenge of cultured rhizobia with peptides provoked symptoms of terminal differentiation. Because NCRs resemble antimicrobial peptides, our findings reveal a previously unknown innovation of the host plant, which adopts effectors of the innate immune system for symbiosis to manipulate the cell fate of endosymbiotic bacteria.

Symbiosis between legumes and Rhizobium bacteria leads to the formation of root nodules where bacteria in the infected plant cells are converted into nitrogen-fixing bacteroids. Nodules with a persistent meristem are indeterminate, whereas nodules without meristem are determinate. The symbiotic plant cells in both nodule types are polyploid because of several cycles of endoreduplication (genome replication without mitosis and cytokinesis) and grow consequently to extreme sizes. Here we demonstrate that differentiation of bacteroids in indeterminate nodules of Medicago and related legumes from the galegoid clade shows remarkable similarity to host cell differentiation. During bacteroid maturation, repeated DNA replication without cytokinesis results in extensive amplification of the entire bacterial genome and elongation of bacteria. This finding reveals a positive correlation in prokaryotes between DNA content and cell size, similar to that in eukaryotes. These polyploid bacteroids are metabolically functional but display increased membrane permeability and are nonviable, because they lose their ability to resume growth. In contrast, bacteroids in determinate nodules of the nongalegoid legumes lotus and bean are comparable to free-living bacteria in their genomic DNA content, cell size, and viability. Using recombinant Rhizobium strains nodulating both legume types, we show that bacteroid differentiation is controlled by the host plant. Plant factors present in nodules of galegoid legumes but absent from nodules of nongalegoid legumes block bacterial cell division and trigger endoreduplication cycles, thereby forcing the endosymbionts toward a terminally differentiated state. Hence, Medicago and related legumes have evolved a mechanism to dominate the symbiosis.

ABSTRACT Methylation of specific DNA sequences is ubiquitous in bacteria and has known roles in immunity and regulation of cellular processes, such as the cell cycle. Using single-molecule real-time sequencing, six genome-wide methylated motifs were identified across four Ensifer strains, five of which were strain-specific. Only the GANTC motif, recognized by the cell cycle-regulated CcrM methyltransferase, was methylated in all strains. In actively dividing cells, methylation of GANTC motifs increased progressively from the ori to ter regions in each replicon, in agreement with a cell cycle-dependent regulation of CcrM. In contrast, there was near full genome-wide GANTC methylation in the early stage of symbiotic differentiation. This was followed by a moderate decrease in the overall extent methylation and a progressive decrease in chromosomal GANTC methylation from the ori to ter regions in later stages of differentiation. We interpret these observations as evidence of dysregulated and constitutive CcrM activity during terminal differentiation, and we hypothesize that it is a driving factor for endoreduplication of terminally differentiated bacteroids.

The spatial organization of gut microbiota is crucial for the functioning of the gut ecosystem, although the mechanisms that organize gut bacterial communities in microhabitats are only partially understood. The gut of the insect Riptortus pedestris has a characteristic microbiota biogeography with a multispecies community in the anterior midgut and a monospecific bacterial population in the posterior midgut. We show that the posterior midgut region produces massively hundreds of specific antimicrobial peptides (AMPs), the Crypt-specific Cysteine-Rich peptides (CCRs) that have membrane-damaging antimicrobial activity against diverse bacteria but posterior midgut symbionts have elevated resistance. We determined by transposon-sequencing the genetic repertoire in the symbiont Caballeronia insecticola to manage CCR stress, identifying different independent pathways, including AMP-resistance pathways unrelated to known membrane homeostasis functions as well as cell envelope functions. Mutants in the corresponding genes have reduced capacity to colonize the posterior midgut, demonstrating that CCRs create a selective barrier and resistance is crucial in gut symbionts. Moreover, once established in the gut, the bacteria differentiate into a CCR-sensitive state, suggesting a second function of the CCR peptide arsenal in protecting the gut epithelia or mediating metabolic exchanges between the host and the gut symbionts. Our study highlights the evolution of an extreme diverse AMP family that likely contributes to establish and control the gut microbiota.

Aerotaxis is the ability of motile cells to navigate towards oxygen. A key question is the dependence of the aerotactic velocity with the local oxygen concentration c . Here we combine simultaneous bacteria tracking and local oxygen concentration measurements using Ruthenium encapsulated in micelles to characterise the aerotactic response of Burkholderia contaminans , a motile bacterium ubiquitous in the environment and present in living organisms. In our experiments, an oxygen gradient is produced by the bacterial respiration in a sealed glass capillary permeable to oxygen at one end, producing a bacterial band travelling towards the oxygen source. We compute the aerotactic response χ ( c ) both at the population scale, from the drift velocity in the bacterial band, and at the bacterial scale, from the angular modulation of the run times. Both methods are consistent with a power-law χ ∝ c − 2 , in good agreement with existing models based on the biochemistry of bacterial membrane receptors.

Abstract Legumes of the Medicago genus form symbiosis with the bacterium Sinorhizobium meliloti and develop root nodules housing large numbers of the intracellular symbionts. Members of the Nodule-specific Cysteine Rich peptide (NCRs) family induce the endosymbionts into a terminal differentiated state. Individual cationic NCRs are antimicrobial peptides that have the capacity to kill the symbiont but the nodule cell environment prevents killing. Moreover, the bacterial broad-specificity peptide uptake transporter BacA and exopolysaccharides contribute to protect the endosymbionts against the toxic activity of NCRs. Here, we show that other S. meliloti functions participate in the protection of the endosymbionts, including an additional broad-specificity peptide uptake transporter encoded by the yejABEF genes, lipopolysaccharide modifications mediated by lpsB and lpxXL as well as rpoH1 , encoding a stress sigma factor. Mutants of these genes show in vitro a strain-specific increased sensitivity profile against a panel of NCRs and form nodules in which bacteroid differentiation is affected. The lpsB mutant nodule bacteria do not differentiate, the lpxXL and rpoH1 mutants form some seemingly fully differentiated bacteroids although most of the nodule bacteria are undifferentiated, while the yejABEF mutants form hypertrophied but nitrogen-fixing bacteroids. The nodule bacteria of all the mutants have a strongly enhanced membrane permeability, which is dependent on the transport of NCRs to the endosymbionts. Our results suggest that S. meliloti relies on a suite of functions including peptide transporters, the bacterial envelope structures and stress response regulators to resist the aggressive assault of NCR peptides in the nodule cells. Importance The nitrogen fixing symbiosis of legumes with rhizobium bacteria has a predominant ecological role in the nitrogen cycle and has the potential to provide the nitrogen required for plant growth in agriculture. The host plants allow the rhizobia to colonize specific symbiotic organs, the nodules, in large numbers in order to produce sufficient reduced nitrogen for the plant needs. Some legumes, including Medicago spp., produce massively antimicrobial peptides to keep this large bacterial population in check. These peptides, known as NCRs, have the potential to kill the rhizobia but in nodules, they rather inhibit the division of the bacteria, which maintain a high nitrogen fixing activity. In this study, we show that the tempering of the antimicrobial activity of the NCR peptides in the Medicago symbiont Sinorhizobium meliloti is multifactorial and requires the YejABEF peptide transporter, the lipopolysaccharide outer membrane composition and the stress response regulator RpoH1.

Abstract Burkholderia vietnamiensis LMG10929 ( Bv ) and Paraburkholderia kururiensis M130 ( Pk ) are bacterial rice growth-promoting models. Besides this common ecological niche, species of the Burkholderia genus are also found as opportunistic human pathogens while Paraburkholderia are mostly environmental and plant-associated species. Here, we compared the genetic strategies used by Bv and Pk to colonize two subspecies of their common host, Oryza sativa ssp. japonica (cv. Nipponbare) and ssp. indica (cv. IR64). We used high-throughput screening of transposon insertional mutant libraries (Tn-seq) to infer which genetic elements have the highest fitness contribution during root surface colonization at 7 days post inoculation. Overall, we detected twice more genes in Bv involved in rice roots colonization compared to Pk , including genes contributing to the tolerance of plant defenses, which suggests a stronger adverse reaction of rice towards Bv compared to Pk . For both strains, the bacterial fitness depends on a higher number of genes when colonizing indica rice compared to japonica . These divergences in host pressure on bacterial adaptation could be partly linked to the cultivar’s differences in nitrogen assimilation. We detected several functions commonly enhancing root colonization in both bacterial strains e.g., Entner-Doudoroff (ED) glycolysis. Less frequently and more strain-specifically, we detected functions limiting root colonization such as biofilm production in Bv and quorum sensing in Pk. The involvement of genes identified through the Tn-seq procedure as contributing to root colonization i.e., ED pathway, c-di-GMP cycling and cobalamin synthesis, was validated by directed mutagenesis and competition with WT strains in rice root colonization assays. Importance Burkholderiaceae are frequent and abundant colonizers of the rice rhizosphere and interesting candidates to investigate for growth promotion. Species of Paraburkholderia have repeatedly been described to stimulate plant growth. However, the closely related Burkholderia genus hosts both beneficial and phytopathogenic species, as well as species able to colonize animal hosts and cause disease in humans. We need to understand to what extent the bacterial strategies used for the different biotic interactions differ depending on the host and if strains with agricultural potential could also pose a threat towards other plant hosts or humans. To start answering these questions, we used here transposon sequencing to identify genetic traits in Burkholderia vietnamiensis and Paraburkholderia kururiensis that contribute to the colonization of two different rice varieties. Our results revealed large differences in the fitness gene sets between the two strains and between the host plants, suggesting a strong specificity in each bacterium-plant interaction.

Abstract Legume plants can form root organs called nodules where they house intracellular symbiotic rhizobium bacteria. Within nodule cells, rhizobia differentiate into bacteroids, which fix nitrogen for the benefit of the plant. Depending on the combination of host plants and rhizobial strains, the output of rhizobium-legume interactions is varying from non-fixing associations to symbioses that are highly beneficial for the plant. Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 was isolated as a soybean symbiont but it can also establish a functional symbiotic interaction with Aeschynomene afraspera . In contrast to soybean, A. afraspera triggers terminal bacteroid differentiation, a process involving bacterial cell elongation, polyploidy and membrane permeability leading to loss of bacterial viability while plants increase their symbiotic benefit. A combination of plant metabolomics, bacterial proteomics and transcriptomics along with cytological analyses was used to study the physiology of USDA110 bacteroids in these two host plants. We show that USDA110 establish a poorly efficient symbiosis with A. afraspera , despite the full activation of the bacterial symbiotic program. We found molecular signatures of high level of stress in A. afraspera bacteroids whereas those of terminal bacteroid differentiation were only partially activated. Finally, we show that in A. afraspera , USDA110 bacteroids undergo an atypical terminal differentiation hallmarked by the disconnection of the canonical features of this process. This study pinpoints how a rhizobium strain can adapt its physiology to a new host and cope with terminal differentiation when it did not co-evolve with such a host. Importance Legume-rhizobium symbiosis is a major ecological process in the nitrogen cycle, responsible for the main input of fixed nitrogen in the biosphere. The efficiency of this symbiosis relies on the coevolution of the partners. Some legume plants, but not all, optimize their return-on-investment in the symbiosis by imposing on their microsymbionts a terminal differentiation program that increases their symbiotic efficiency but imposes a high level of stress and drastically reduce their viability. We combined multi-omics with physiological analyses to show that the non-natural symbiotic couple formed by Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 and Aeschynomene afraspera is functional but displays a low symbiotic efficiency associated to a disconnection of terminal bacteroid differentiation features.

Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) are a rapidly expanding and largely untapped class of natural products with various biological activities. Linear azol(in)e-containing peptides (LAPs) comprise a subclass of RiPPs that display an outstanding diversity of mechanisms of action while sharing common structural features. Here, we report the discovery of a new LAP biosynthetic gene cluster in the genome of Rhizobium sp. Pop5, which encodes the precursor peptide and modification machinery of phazolicin (PHZ) – an extensively modified peptide exhibiting narrow-spectrum antibacterial activity against some symbiotic bacteria of leguminous plants belonging to the Rhizobiales. PHZ inhibits prokaryotic translation through the obstruction of the passage of the nascent peptide through the ribosome exit channel. The cryo-EM structure of the Escherichia coli ribosome with bound PHZ revealed that the drug interacts with the 23S rRNA and ribosomal proteins uL4 and uL22 and obstructs the exit tunnel in a way that is distinct from other compounds blocking the exit channel. We show that the sequence of uL4 ribosomal protein loop involved in PHZ binding determines the species-specificity of antibiotic interaction with its target. PHZ and its predicted homologs from other bacterial species expand the known diversity of LAPs and may be used in the future as biocontrol agents for the needs of agriculture.

Abstract Members of gut microbiota are confronted by the epithelial immune system suggesting that resistance is crucial for chronical gut colonization. We show that the insect Riptortus pedestris produces massively hundreds of specific antimicrobial peptides (AMPs), the Crypt-specific Cysteine-Rich peptides (CCRs), in the posterior midgut that houses a mono-specific bacterial community. CCRs have membrane-damaging antimicrobial activity against diverse bacteria but gut symbionts have elevated resistance. Tn-seq determined the genetic repertoire in the gut symbiont Caballeronia insecticola to manage AMP stress, identifying novel pathways targeted by AMPs in addition to cell envelope functions. Mutants in the corresponding genes have reduced capacity to colonize the gut, demonstrating that CCRs create a selective barrier and resistance is a key attribute of gut symbionts.