Lipid nanoparticle (LNP) delivery of CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) has the potential to enable high-efficiency in vivo genome editing with low toxicity and an easily manufactured technology, if RNP efficacy can be maintained during LNP production. In this study, we engineered a thermostable Cas9 from Geobacillus stearothermophilus (GeoCas9) using directed evolution to generate iGeoCas9 evolved variants capable of robust genome editing of cells and organs. iGeoCas9s were significantly better at editing cells than wild-type GeoCas9, with genome editing levels >100X greater than those induced by the native GeoCas9 enzyme. Furthermore, iGeoCas9 RNP:LNP complexes edited a variety of cell lines and induced homology-directed repair (HDR) in cells receiving co-delivered single-stranded DNA (ssDNA) templates. Using tissue-selective LNP formulations, we observed genome editing of 35‒56% efficiency in the liver or lungs of mice that received intravenous injections of iGeoCas9 RNP:LNPs. In particular, iGeoCas9 complexed to acid-degradable LNPs edited lung tissue in vivo with an average of 35% efficiency, a significant improvement over editing efficiencies observed previously using viral or non-viral delivery strategies. These results show that thermostable Cas9 RNP:LNP complexes are a powerful alternative to mRNA:LNP delivery vehicles, expanding the therapeutic potential of genome editing.

Abstract Lipid nanoparticle (LNP) delivery of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) ribonucleoproteins (RNPs) could enable high-efficiency, low-toxicity and scalable in vivo genome editing if efficacious RNP–LNP complexes can be reliably produced. Here we engineer a thermostable Cas9 from Geobacillus stearothermophilus (GeoCas9) to generate iGeoCas9 variants capable of >100× more genome editing of cells and organs compared with the native GeoCas9 enzyme. Furthermore, iGeoCas9 RNP–LNP complexes edit a variety of cell types and induce homology-directed repair in cells receiving codelivered single-stranded DNA templates. Using tissue-selective LNP formulations, we observe genome-editing levels of 16‒37% in the liver and lungs of reporter mice that receive single intravenous injections of iGeoCas9 RNP–LNPs. In addition, iGeoCas9 RNPs complexed to biodegradable LNPs edit the disease-causing SFTPC gene in lung tissue with 19% average efficiency, representing a major improvement over genome-editing levels observed previously using viral or nonviral delivery strategies. These results show that thermostable Cas9 RNP–LNP complexes can expand the therapeutic potential of genome editing.

Abstract Nanoparticle-based drug delivery systems have the potential to revolutionize medicine but their low vascular permeability and rapid clearance by phagocytic cells have limited their medical impact. Nanoparticles delivered at the in utero stage have the potential to overcome these key limitations, due to the high rate of angiogenesis and cell division in fetal tissue, and the under-developed immune system. However, very little is known about nanoparticle drug delivery at the fetal stage of development. In this report, using Ai9 CRE reporter mice, we demonstrate that lipid nanoparticle (LNP) mRNA complexes can deliver mRNA for gene editing enzymes in utero after an intrahepatic injection, and can access and edit major organs, such as the heart, the liver, kidneys, lungs and the gastrointestinal tract with remarkable efficiency and low toxicity. In addition, we show here that Cas9 mRNA and sgRNA complexed to LNPs were able to edit the fetal organs in utero after an intrahepatic injection. These experiments demonstrate the possibility of non-viral delivery of gene editing enzymes in utero and nanoparticle drug delivery has great potential for delivering macromolecules to organs outside of the liver in utero , which provides a promising strategy for treating a wide variety of devastating genetic diseases before birth.

SF6 gas, commonly used as an insulation and arc-quenching medium in high-voltage electrical equipment, has garnered considerable attention regarding its recovery and treatment after use. Addressing the challenge of calculating and measuring gas recovery rates during on-site operations, this paper proposes an estimation model based on KNN-IChOA-KELM. The approach begins by establishing an SF6 recovery rate estimation model using Kernel Extreme Learning Machine (KELM). To enhance the model's generalization capability, an improved chimpanzee algorithm is employed to optimize the KELM parameters. Subsequently, in cases where certain samples exhibit significant error deviations, the KNearest Neighbors (KNN) algorithm is applied for classification. After classification, the IChOA-KELM model is utilized for SF6 recovery rate estimation. Finally, the proposed method's accuracy is analyzed through comparison with four other estimation methods: IChOA-BP, IChOA-SVM, IChOA-RF, and IChOA-LSTM. Case study results demonstrate that the SF6 recovery rate estimation method presented in this paper achieves at least a 0.07% improvement in Mean Absolute Percentage Error (MAPE) and a 0.11% improvement in Root Mean Square Error (RMSE) compared to the other methods.