Immune mechanisms are known to control the pathogenesis of atherosclerosis. However, the exact role of DCs, which are essential for priming of immune responses, remains elusive. We have shown here that the DC-derived chemokine CCL17 is present in advanced human and mouse atherosclerosis and that CCL17+ DCs accumulate in atherosclerotic lesions. In atherosclerosis-prone mice, Ccl17 deficiency entailed a reduction of atherosclerosis, which was dependent on Tregs. Expression of CCL17 by DCs limited the expansion of Tregs by restricting their maintenance and precipitated atherosclerosis in a mechanism conferred by T cells. Conversely, a blocking antibody specific for CCL17 expanded Tregs and reduced atheroprogression. Our data identify DC-derived CCL17 as a central regulator of Treg homeostasis, implicate DCs and their effector functions in atherogenesis, and suggest that CCL17 might be a target for vascular therapy.

Owing to its roles in cellular signal transduction, protein phosphorylation plays critical roles in myriad cell processes. That said, detecting and quantifying protein phosphorylation has remained a challenge. We describe the use of a novel mass spectrometer (Orbitrap Astral) coupled with data-independent acquisition (DIA) to achieve rapid and deep analysis of human and mouse phosphoproteomes. With this method we map approximately 30,000 unique human phosphorylation sites within a half-hour of data collection. The technology was benchmarked to other state-of-the-art MS platforms using both synthetic peptide standards and with EGF-stimulated HeLa cells. We applied this approach to generate a phosphoproteome multi-tissue atlas of the mouse. Altogether, we detected 81,120 unique phosphorylation sites within 12 hours of measurement. With this unique dataset, we examine the sequence, structural, and kinase specificity context of protein phosphorylation. Finally, we highlight the discovery potential of this resource with multiple examples of novel phosphorylation events relevant to mitochondrial and brain biology.

Owing to its roles in cellular signal transduction, protein phosphorylation plays critical roles in myriad cell processes. That said, detecting and quantifying protein phosphorylation has remained a challenge. We describe the use of a novel mass spectrometer (Orbitrap Astral) coupled with data-independent acquisition (DIA) to achieve rapid and deep analysis of human and mouse phosphoproteomes. With this method, we map approximately 30,000 unique human phosphorylation sites within a half-hour of data collection. The technology is benchmarked to other state-of-the-art MS platforms using both synthetic peptide standards and with EGF-stimulated HeLa cells. We apply this approach to generate a phosphoproteome multi-tissue atlas of the mouse. Altogether, we detect 81,120 unique phosphorylation sites within 12 hours of measurement. With this unique dataset, we examine the sequence, structural, and kinase specificity context of protein phosphorylation. Finally, we highlight the discovery potential of this resource with multiple examples of phosphorylation events relevant to mitochondrial and brain biology.

Mitochondria vary in morphology and function in different tissues, however little is known about their molecular diversity among cell types. To investigate mitochondrial diversity in vivo, we developed an efficient protocol to isolate cell type-specific mitochondria based on a new MitoTag mouse. We profiled the mitochondrial proteome of three major neural cell types in cerebellum and identified a substantial number of differential mitochondrial markers for these cell types in mice and humans. Based on predictions from these proteomes, we demonstrate that astrocytic mitochondria metabolize long-chain fatty acids more efficiently than neurons. Moreover, we identified Rmdn3 as a major determinant of ER-mitochondria proximity in Purkinje cells. Our novel approach enables exploring mitochondrial diversity on the functional and molecular level in many in vivo contexts.

ABSTRACT Inflammation in the central nervous system (CNS) can impair the function of neuronal mitochondria and contributes to axon degeneration in the common neuroinflammatory disease multiple sclerosis (MS). Here we combine cell type-specific mitochondrial proteomics with in vivo biosensor imaging to dissect how inflammation alters the molecular composition and functional capacity of neuronal mitochondria. We show that neuroinflammatory lesions in the mouse spinal cord cause widespread and persisting axonal ATP deficiency, which precedes mitochondrial oxidation and calcium overload. This axonal energy deficiency is associated with impaired electron transport chain function, but also an upstream imbalance of tricarboxylic acid (TCA) cycle enzymes, with several, including key rate-limiting, enzymes being depleted in neuronal mitochondria in experimental models and in MS lesions. Notably, viral overexpression of individual TCA enzymes can ameliorate the axonal energy deficits in neuroinflammatory lesions, suggesting that TCA cycle dysfunction in MS may be amendable to therapy.