The role of chromosomal inversions in adaptation and speciation is controversial. Historically, inversions were thought to contribute to these processes either by directly causing hybrid sterility or by facilitating the maintenance of co-adapted gene complexes. Because inversions suppress recombination when heterozygous, a recently proposed local adaptation mechanism predicts that they will spread if they capture alleles at multiple loci involved in divergent adaptation to contrasting environments. Many empirical studies have found inversion polymorphisms linked to putatively adaptive phenotypes or distributed along environmental clines. However, direct involvement of an inversion in local adaptation and consequent ecological reproductive isolation has not to our knowledge been demonstrated in nature. In this study, we discovered that a chromosomal inversion polymorphism is geographically widespread, and we test the extent to which it contributes to adaptation and reproductive isolation under natural field conditions. Replicated crosses between the prezygotically reproductively isolated annual and perennial ecotypes of the yellow monkeyflower, Mimulus guttatus, revealed that alternative chromosomal inversion arrangements are associated with life-history divergence over thousands of kilometers across North America. The inversion polymorphism affected adaptive flowering time divergence and other morphological traits in all replicated crosses between four pairs of annual and perennial populations. To determine if the inversion contributes to adaptation and reproductive isolation in natural populations, we conducted a novel reciprocal transplant experiment involving outbred lines, where alternative arrangements of the inversion were reciprocally introgressed into the genetic backgrounds of each ecotype. Our results demonstrate for the first time in nature the contribution of an inversion to adaptation, an annual/perennial life-history shift, and multiple reproductive isolating barriers. These results are consistent with the local adaptation mechanism being responsible for the distribution of the two inversion arrangements across the geographic range of M. guttatus and that locally adaptive inversion effects contribute directly to reproductive isolation. Such a mechanism may be partially responsible for the observation that closely related species often differ by multiple chromosomal rearrangements.

Abstract Understanding how and why populations evolve is of fundamental importance to molecular ecology. Restriction site‐associated DNA sequencing ( RAD seq), a popular reduced representation method, has ushered in a new era of genome‐scale research for assessing population structure, hybridization, demographic history, phylogeography and migration. RAD seq has also been widely used to conduct genome scans to detect loci involved in adaptive divergence among natural populations. Here, we examine the capacity of those RAD seq‐based genome scan studies to detect loci involved in local adaptation. To understand what proportion of the genome is missed by RAD seq studies, we developed a simple model using different numbers of RAD ‐tags, genome sizes and extents of linkage disequilibrium (length of haplotype blocks). Under the best‐case modelling scenario, we found that RAD seq using six‐ or eight‐base pair cutting restriction enzymes would fail to sample many regions of the genome, especially for species with short linkage disequilibrium. We then surveyed recent studies that have used RAD seq for genome scans and found that the median density of markers across these studies was 4.08 RAD ‐tag markers per megabase (one marker per 245 kb). The length of linkage disequilibrium for many species is one to three orders of magnitude less than density of the typical recent RAD seq study. Thus, we conclude that genome scans based on RAD seq data alone, while useful for studies of neutral genetic variation and genetic population structure, will likely miss many loci under selection in studies of local adaptation.

ABSTRACT Local adaptation is a key driver of ecological specialization and the formation of new species. Despite its importance, the evolution of gene regulatory divergence among locally-adapted populations is poorly understood, especially how that divergence manifests in nature. Here, we evaluate gene expression divergence and allele-specific gene expression responses for locally-adapted coastal perennial and inland annual accessions of the yellow monkeyflower, Mimulus guttatus , in a field reciprocal transplant experiment. Overall, 6765 (73%) of surveyed genes were differentially expressed between coastal and inland habitats, while 7213 (77%) were differentially expressed between the coastal perennial and inland annual accessions. Further, 18% of transcripts had significant genotype x site (GxE) effects. Habitat-specific differential expression was found for 62% of the GxE transcripts (differential expression in one habitat, but not the other), while only 94 (∼5%) GxE transcripts had crossing reaction norms. Cis -regulatory variation was pervasive, affecting 79% (5532) of differentially expressed genes. We detected trans effects for 52% (3611) of differentially expressed genes. Consistent with the supergene hypothesis of chromosome inversion evolution, a locally adaptive inversion was enriched for cis -regulatory divergence. These results provide multiple new insights into the evolution of transcriptome-wide gene regulatory divergence and plasticity among locally adapted populations.

Abstract Plant phenological timings are major fitness components affected by multiple environmental cues; thus, phenological traits can have important genotype-by-environment interactions (GxE). We use a flexible, data-driven method to characterize GxE in the timing of vegetative growth (‘green-up’) and flowering across eight environments and in two highly divergent switchgrass ( Panicum virgatum ) populations. We classified polygenic GxE patterns as suggestive of modulation of genetic effects via weather-based cues—or other, unknown modulators. >26% of Gulf population SNPs affecting flowering had effects that covaried with photoperiodicity and >34% of Midwest upland population SNPs affecting flowering had effects that covaried with cumulative growing degree days. 76% of SNP effects on green-up showed antagonistic pleiotropy, a change in effect sign, between environments native to Gulf plants (Texas) and environments native to Midwest plants (North). In contrast, <2% of flowering effects showed antagonistic pleiotropy; the majority (>64%) showed no GxE. Top GxE-associated SNPs were highly enriched in the top associations from an independent pseudo-F2 cross of individuals from the same two populations. Breeding for particular alleles at GxE-associated loci could change flowering responsiveness to photoperiod cues in switchgrass. More broadly, this approach could be used to flexibly characterize patterns of GxE across species, populations and environments. Significance Statement The timing of plant seasonal development (phenology) has major impacts on fitness because of the negative consequences of plant-environment mismatches. Here we map the genetic basis of two phenological events, the start of above-ground growth and flowering, in two genetically and phenologically distinct populations of switchgrass. We do this at eight field locations spanning the latitudinal range of both populations. Our approach allows us to identify regions of the genome with effects that covary with weather-related environmental features at every location. For flowering, these features differed by population: the Midwest population had genetic effects that primarily covaried with cumulative growing degree days, a temperature-related measure, while the Gulf population had genetic effects that primarily covaried with photoperiod, a day-length-related measure.

Abstract Large chromosomal inversion polymorphisms are ubiquitous across the diversity of diploid organisms and play a large role in the evolution of adaptations in those species. Despite their importance, the underlying mechanisms by which inversions produce their adaptive phenotypic effects and become geographically widespread are still poorly understood. One way inversions could cause phenotypic effects is through meiotic recombination suppression, which can result in the formation of a supergene containing linked adaptive alleles. This supergene hypothesis has been promoted by theoreticians, but thus far, no studies have definitively identified multiple linked adaptive genes within an inversion. Alternatively, according to the breakpoint mutation hypothesis, the inversion mutation itself could result in adaptive phenotypic effects if it disrupts genes or alters regulation of nearby genes. Here, we evaluate both of these hypotheses using new long-read sequencing-based genomes of the yellow monkey flower, Mimulus guttatus . Our results provide support for both the supergene and breakpoint mutation hypotheses of adaptive inversion evolution and suggest that functional molecular studies will be required to definitively test each of these hypotheses. We also identified an ancient large inversion nested within a well-established adaptive inversion. This finding suggests that the supergene mechanism may occur in phases, with an expansion of the region of suppressed recombination capturing an increasing number of adaptive loci over time. Significance statement Large regions of chromosomes can become reversed in orientation due to mutations known as inversions. These inversions are often involved in the evolution of major organismal adaptations, yet we know little about this process. In this study, we show that the evolution of a large adaptive inversion in monkeyflowers could be due to both the trapping of beneficial genes into a supergene as well as changes in gene expression due to the inversion mutation itself. Further, we found that this inversion has trapped an even older inversion, which may itself have been adaptive. Thus, adaptive inversions on autosomes may evolve in sequence, much the same way that sex chromosomes evolve.

Abstract Leaf fungal microbiomes can be fundamental drivers of host plant success, as they contain pathogens that devastate crop plants and taxa that enhance nutrient uptake, discourage herbivory, and antagonize pathogens. We measured leaf fungal diversity with amplicon sequencing across an entire growing season in a diversity panel of switchgrass ( Panicum virgatum ). We also sampled a replicated subset of genotypes across three additional sites to compare the importance of time, space, ecology, and genetics. We found a strong successional pattern in the microbiome shaped both by host genetics and environmental factors. Further, we used genome-wide association mapping and RNA-sequencing to show that three cysteine-rich receptor-like kinases were linked to a genetic locus associated with microbiome structure. These genes were more highly expressed in genotypes susceptible to fungal pathogens, which were central to microbial covariance networks, suggesting that host immune genes are a principal means of controlling the entire leaf microbiome.

Abstract Spatial segregation of closely related species is usually attributed to differences in stress tolerance and competitive ability. For both animals and plants, reproductive interactions between close relatives can impose a fitness cost that is more detrimental to the rarer species. Frequencydependent mating interactions may thus prevent the establishment of immigrants within heterospecific populations, maintaining spatial segregation of species. Despite strong spatial segregation in natural populations, two sympatric California monkeyflowers (Mimulus nudatus and M. guttatus ) survive and reproduce in the other’s habitat when transplanted reciprocally. We hypothesized that a frequency-dependent mating disadvantage maintains spatial segregation of these monkeyflowers during natural immigration. To evaluate this hypothesis, we performed two field experiments. First, we experimentally added immigrants in varying numbers to sites dominated by heterospecifics. Second, we reciprocally transplanted arrays of varying resident and immigrant frequencies. Immigrant seed viability decreased with conspecific rarity for M. guttatus , but not M. nudatus . We observed immigrant minority disadvantage for both species, but driven by different factors– frequency-dependent hybridization for M. guttatus , and competition for resources and/or pollinators for M. nudatus. Overall, our results suggest a major role for reproductive interference in spatial segregation that should be evaluated along with stress tolerance and competitive ability.

Abstract A major challenge in evolutionary biology is identifying the selective agents and phenotypes underlying local adaptation. Local adaptation along environmental gradients may be driven by trade-offs in allocation to reproduction, growth, and herbivore resistance. To identify environmental agents of selection and their phenotypic targets, we performed a manipulative field reciprocal transplant experiment with coastal perennial and inland annual ecotypes of the common yellow monkeyflower ( Mimulus guttatus ). We manipulated herbivory with exclosures built in the field and exogenously manipulated hormones to shift allocation of plant resources among growth, reproduction, and herbivore resistance. Our hormone treatments influenced allocation to reproduction and phytochemical defense, but this shift was small relative to ecotype differences in allocation. Herbivore exclosures reduced herbivory and increased fitness of plants at the coastal site. However, this reduction in herbivory did not decrease the homesite advantage of coastal perennials. Unexpectedly, we found that the application of exogenous gibberellin increased mortality due to salt spray at the coastal site for both ecotypes. Our results suggest that divergence in salt spray tolerance, potentially mediated by ecotype differences in gibberellin synthesis or bioactivity, is a strong driver of local adaptation and preempts any impacts of herbivory in coastal habitats that experience salt spray.

ABSTRACT Stable transformation is the biggest challenge for studying gene function in plants. In most plant species, stable transformation requires the development of arduous tissue culture and regeneration methods that often fail and can cause undesirable genetic changes. Floral transformation methods bypass these challenges by infiltrating Agrobacterium directly into the ovules of developing flowers. However, this method has had limited success outside of a handful of plant species and genotypes within those species. Here, we demonstrate that the floral infiltration method is effective for some, but not all genotypes of the yellow monkeyflower, Mimulus guttatus , a model system for studies of ecology and evolution. To conduct transformation in genotypes where infiltration failed, we developed a novel floral injection method. Beyond expanding the number of genotypes that can be transformed, the floral injection method has other advantages, such as allowing plants to be infiltrated multiple times and a reduction in floral abscission and male sterility. Through a combination of floral infiltration and injection methods, we were able to transform both coastal perennial and inland annual genotypes of M. guttatus , which sets the stage for understanding the molecular genetic underpinnings of local adaptation to the divergent habitats occupied by these distinctive ecotypes. Overall, the development of these efficient transformation methods will open up a wide range of new research avenues in the M. guttatus species complex.

Summary In widespread species, parasites can locally adapt to host populations, or hosts can locally adapt to resist parasites. Parasites with rapid life cycles locally adapt more quickly, but host diversity, selective pressure, and climatic factors impact coevolution. To better understand local adaptation in co-evolved host-parasite systems, we examined switchgrass ( Panicum virgatum ), and its leaf rust pathogen ( Puccinia novopanici ) across a latitudinal range in North America. We grew diverse switchgrass genotypes in ten replicated common gardens spanning 16.78° latitude for three years, measuring rust severity from natural infection. We conducted genome wide association mapping to identify genetic loci associated with rust severity. Genetically differentiated rust populations were locally adapted to northern and southern switchgrass, despite host local adaptation in the same regions. Rust resistance was highly polygenic, and distinct loci were associated with rust severity in the north and south. We narrowed a previously identified large-effect QTL for rust severity to a candidate YSL3 -like gene, and linked numerous other loci to immunity-related genes. Both hosts and parasites can be locally adapted when parasites have a lower impact on fitness than other local selection pressures. In switchgrass, our results suggest variation in fungal resistance mechanisms between locally adapted regions.