Abstract Ufmylation, a protein modification by Ubiquitin-like (UBL) protein UFM1, plays a crucial role in several cellular processes including DNA damage response, protein translation and ER homeostasis. To date, little is known how the enzymes responsible for this modification coordinate their action. Here we have studied the details of UFL1 (E3) activity, its binding to UFC1 (E2), and its relation to UBA5 (E1), using a combination of structural modeling with Alphafold2, X-ray crystallography, NMR, and in vitro biochemical activity assays. Guided by an Alphafold2 model, we generated an active UFL1 fusion construct that includes its cofactor DDRGK1, and solved the first crystal structure of this critical interaction. This fusion construct also unveiled the importance of the N-terminal helix of UFL1 for its binding to UFC1, which was validated by ITC and NMR experiments. Importantly, the binding site suggested by our structural model of the UFL1-UFC1 interaction reveals a conserved interface, and suggests a competition for binding to UFC1 between UFL1 and UBA5, which we reconfirmed by NMR. Altogether, our study reveals a novel, terminal helix-mediated regulatory mechanism which coordinates the cascade of E1-E2-E3 mediated transfer of UFM1 to its substrate, and provides new leads to target this important modification. Significance statement Ufmylation is an important post-translational modification, but little is known about the mechanistic details of its machinery, and in particular how the UFM1 E3 ligase (UFL1) binds and functions together with the E2 conjugating enzyme (UFC1). We combined AlphaFold2 modeling, X-ray crystallography, NMR and biochemical experiments to reveal crucial elements that govern UFL1 activity and ufmylation. We discover a crucial role for the UFL1 N-terminal helix in binding to UFC1 and productive ufmylation. This helix competes with the E1 (UBA5) C-terminal helix for binding to UFC1. Altogether, our findings uncover a new, helix-mediated regulatory mechanism in ufmylation.

Abstract It was shown previously that the Matrix (M), Phosphoprotein (P), and the Fusion (F) proteins of Respiratory syncytial virus (RSV) are sufficient to produce virus-like particles (VLPs) that resemble the RSV infection-induced virions. However, the exact mechanism and interactions among the three proteins are not known. This work examines the interaction between P and M during RSV assembly and budding. We show that M interacts with P in the absence of other viral proteins in cells using a Split Nano Luciferase assay. By using recombinant proteins, we demonstrate a direct interaction between M and P. By using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) we identify three novel M interaction sites on P, namely site I in the α N2 region, site II in the 115-125 region, and the oligomerization domain (OD). We show that the OD, and likely the tetrameric structural organization of P, is required for virus-like filament formation and VLP release. Although sites I and II are not required for VLP formation, they appear to modulate P levels in RSV VLPs. Importance Human RSV is the commonest cause of infantile bronchiolitis in the developed world and of childhood deaths in resource-poor settings. It is a major unmet target for vaccines and anti-viral drugs. The lack of knowledge of RSV budding mechanism presents a continuing challenge for VLP production for vaccine purpose. We show that direct interaction between P and M modulates RSV VLP budding. This further emphasizes P as a central regulator of RSV life cycle, as an essential actor for transcription and replication early during infection and as a mediator for assembly and budding in the later stages for virus production.

J-domain proteins (JDPs) constitute a large family of molecular chaperones that bind a broad spectrum of substrates, targeting them to Hsp70, thus determining the specificity and activating the entire chaperone functional cycle. The malfunction of JDPs is therefore inextricably linked to myriad human disorders. Here we uncover a novel mechanism by which chaperones recognize misfolded clients, present in class-A JDPs. Through a newly-identified beta-hairpin site, these chaperones detect changes in protein dynamics at the initial stages of misfolding, prior to exposure of hydrophobic regions or large structural rearrangements. The JDPs then sequester misfolding-prone proteins into large oligomeric assemblies, protecting them from aggregation. Through this mechanism, class-A JDPs bind destabilized p53 mutants, preventing clearance of these oncoproteins by Hsp70-mediated degradation, thus promoting cancer progression. Removal of the beta-hairpin abrogates this protective activity while minimally affecting other chaperoning functions. This suggests the class-A JDP beta-hairpin as a highly specific target for cancer therapeutics.

ABSTRACT The microtubule-associated protein, tau, is the major subunit of neurofibrillary tangles, forming insoluble, amyloid-type aggregates associated with neurodegenerative conditions, such as Alzheimer’s disease. Tau aggregation, however, can be prevented in the cell by a class of proteins known as molecular chaperones, which play important roles in maintaining protein homeostasis. While numerous chaperones are known to interact with tau, though, little is known about the detailed mechanisms by which these prevent tau aggregation. Here, we describe the effects of the ATP-independent Hsp40 chaperones, DNAJA2 and DNAJB1, on tau amyloid fiber formation and compare these to the well-studied small heat shock protein HSPB1. We find that each chaperone prevents tau aggregation differently, by interacting with distinct sets of tau species along the aggregation pathway and thereby affecting their incorporation into fibers. Whereas HSPB1 only binds tau monomers, DNAJB1 and DNAJA2 recognize aggregation-prone tau conformers and even mature fibers, thus efficiently preventing formation of tau amyloids. In addition, we find that both Hsp40s bind tau seeds and fibers via their C-terminal domain II (CTDII), with DNAJA2 being further capable of recognizing tau monomers by a second, different site in CTDI. These results provide important insight into the molecular mechanism by which the different members of the Hsp40 chaperone family counteract the formation, propagation, and toxicity of tau aggregates. Furthermore, our findings highlight the fact that chaperones from different families and different classes play distinct, but complementary roles in preventing pathological protein aggregation.