Abstract To ensure their survival, animals must be able to respond adaptively to threats within their environment. However, the precise neural circuit mechanisms that underlie such flexible defensive behaviors remain poorly understood. Using neuronal manipulations, machine-learning-based behavioral detection, Electron Microscopy (EM) connectomics and calcium imaging in Drosophila larva, we have mapped the second-order interneurons differentially involved in the competition between different defensive actions and the main pathways to the motor side putatively involved in inhibiting startle-type behaviors and promoting escape behaviors in a context dependent manner. We found that mechanosensory stimulation modulates the nociceptive escape sequences and inhibits C-shape bends and Rolls in favor of startle-like behaviors. This suggests a competition between mechanosensory-induced startle responses and escape behaviors. Structural and functional connectivity revealed that the second order interneurons receive their main input from projection neurons that integrate mechanosensory and nociceptive stimuli. The analysis of their postsynaptic connectivity in EM revealed that they make indirect connections to the pre-motor and motor neurons. Finally, we identify a pair of descending neurons that could promote modulate the escape sequence and promote startle behaviors. Altogether, these results characterize the pathways involved in the Startle and Escape competition, modulated by the sensory context.

Abstract Animals’ feeding state changes behavioral priorities and thus influences even non-feeding related decisions. How is the feeding state information transmitted to non-feeding related circuits and what are the circuit mechanisms involved in biasing non-feeding related decisions remains an open question. By combining calcium imaging, neuronal manipulations, behavioral analysis and computational modeling, we determined that the competition between different aversive responses to mechanical cues is biased by feeding state changes. We found that this is achieved by differential modulation of two different types of reciprocally connected inhibitory neurons promoting opposing actions. This modulation results in a more frequent active type of response and less frequently a protective type of response if larvae are fed sugar compared to when they are fed a balanced diet. The information about the internal state is conveyed to the inhibitory neurons through homologues of the vertebrate neuropeptide Y known to be involved in regulating feeding behavior.

Nervous systems across the animal kingdom have the ability to select appropriate actions and sequences of actions in response to sensory cues. The circuit mechanisms by which nervous systems achieve choice, stability and transitions between behaviors are still incompletely understood. To identify neurons and brain areas involved in controlling these processes, we developed an approach where we combined a large-scale neuronal inactivation screen with an automated action detection of sensorimotor decisions and sequences in response to a sensory cue in Drosophila larva. We analyzed behaviors from 2.9x105 larvae and identified 51 candidate lines for sensory processing and 24 candidate lines for competitive interactions between actions during sensorimotor decisions. We also detected phenotype categories for sequence transitions consistent with a model of sequence generation where transitions and reversals are independently controlled. These findings provide the basis for understanding how sensorimotor decisions and sequence transition are controlled by the nervous system.

Motivation As more behavioural assays are carried out in large-scale experiments on Drosophila larvae, the definitions of the archetypal actions of a larva are regularly refined. In addition, video recording and tracking technologies constantly evolve. Consequently, automatic tagging tools for Drosophila larval behaviour must be retrained to learn new representations from new data. However, existing tools cannot transfer knowledge from large amounts of previously accumulated data. We introduce LarvaTagger, a piece of software that combines a pre-trained deep neural network, providing a continuous latent representation of larva actions for stereotypical behaviour identification, with a graphical user interface to manually tag the behaviour and train new automatic taggers with the updated ground truth. Results We reproduced results from an automatic tagger with high accuracy, and we demonstrated that pre-training on large databases accelerates the training of a new tagger, achieving similar prediction accuracy using less data. Availability All the code is free and open source. Docker images are also available. See git-lab.pasteur.fr/nyx/LarvaTagger.jl .

Abstract The central nervous system can generate various behaviours, including motor responses, which we can observe through video recordings. Recent advancements in genetics, automated behavioural acquisition at scale, and machine learning enable us to link behaviours to their underlying neural mechanisms causally. Moreover, in some animals, such as the Drosophila larva, this mapping is possible at unprecedented scales of millions of animals and single neurons, allowing us to identify the neural circuits generating particular behaviours. These high-throughput screening efforts are invaluable, linking the activation or suppression of specific neurons to behavioural patterns in millions of animals. This provides a rich dataset to explore how diverse nervous system responses can be to the same stimuli. However, challenges remain in identifying subtle behaviours from these large datasets, including immediate and delayed responses to neural activation or suppression, and understanding these behaviours on a large scale. We introduce several statistically robust methods for analyzing behavioural data in response to these challenges: 1) A generative physical model that regularizes the inference of larval shapes across the entire dataset. 2) An unsupervised kernel-based method for statistical testing in learned behavioural spaces aimed at detecting subtle deviations in behaviour. 3) A generative model for larval behavioural sequences, providing a benchmark for identifying complex behavioural changes. 4) A comprehensive analysis technique using suffix trees to categorize genetic lines into clusters based on common action sequences. We showcase these methodologies through a behavioural screen focused on responses to an air puff, analyzing data from 280,716 larvae across 568 genetic lines. Author Summary There is a significant gap in understanding between the architecture of neural circuits and the mechanisms of action selection and behaviour generation. Drosophila larvae have emerged as an ideal platform for simultaneously probing behaviour and the underlying neuronal computation [1]. Modern genetic tools allow efficient activation or silencing of individual and small groups of neurons. Combining these techniques with standardized stimuli over thousands of individuals makes it possible to relate neurons to behaviour causally. However, extracting these relationships from massive and noisy recordings requires the development of new statistically robust approaches. We introduce a suite of statistical methods that utilize individual behavioural data and the overarching structure of the behavioural screen to deduce subtle behavioural changes from raw data. Given our study’s extensive number of larvae, addressing and preempting potential challenges in body shape recognition is critical for enhancing behaviour detection. To this end, we have adopted a physics-informed inference model. Our first group of techniques enables robust statistical analysis within a learned continuous behaviour latent space, facilitating the detection of subtle behavioural shifts relative to reference genetic lines. A second array of methods probes for subtle variations in action sequences by comparing them to a bespoke generative model. Together, these strategies have enabled us to construct representations of behavioural patterns specific to a lineage and identify a roster of ”hit” neurons with the potential to influence behaviour subtly.

Small animals use sensory information to navigate their environment in order to reach more favorable conditions. In gradients of light, temperature, odors and C02, Drosophila larvae alternate periods of runs and turns, regulating the frequency size and direction of turns, to move in a favorable direction. Whether larvae use the same strategies when navigating in response to somatosensory input is unknown. Further, while many of the sensory neurons that mediate navigation behaviors have been described, where and how these navigational strategies are implemented in the central nervous system and controlled by neuronal circuit elements is not well known. Here we characterize for the first time the navigational strategies of Drosophila larvae in gradients of air-current speeds using high-throughput behavioral assays and quantitative behavioral analysis. We find that larvae extend runs towards favorable directions and shorten runs in unfavorable directions, and that larvae regulate both the direction and amplitudes of turns. These results suggest similar central decision-making mechanisms underlie navigation behaviors in somatosensory and other sensory modalities. By silencing the activity of individual neurons and very sparse expression patterns (2 or 3 neuron types), we further identify the sensory neurons and circuit elements in the ventral nerve cord and brain of the larva required for navigational decisions during anemotaxis. The phenotypes of these central neurons are consistent with a mechanism where the increase of the turning rate in unfavorable conditions and decrease in turning rate in favorable conditions are independently controlled. In addition, we find phenotypes that suggest that the decisions of whether and which way to turn are controlled independently. Our study reveals that different neuronal modules in the nerve cord and brain mediate different aspects of navigational decision making. The neurons identified in our screen provide a basis for future detailed mechanistic understanding of the circuit principles of navigational decision-making.