Abstract Single-molecule FRET (smFRET) has become an established tool to study biomolecular structure and dynamics in vitro and in live cells. We performed a worldwide blind study involving 19 labs to assess the uncertainty of FRET experiments for proteins with respect to the measured FRET efficiency histograms, determination of distances, and the detection and quantification of structural dynamics. Using two protein systems that undergo distinct conformational changes, we obtained an uncertainty of the FRET efficiency of less than ± 0.06, corresponding to an interdye distance precision of ≤ 0.2 nm and accuracy of ≤ 0.5 nm. We further discuss the limits for detecting distance fluctuations with sensitivity down to ≲ 10% of the Förster distance and provide guidelines on how to detect potential dye perturbations. The ability of smFRET experiments to simultaneously measure distances and avoid averaging of conformational dynamics slower than the fluorescence lifetime is unique for dynamic structural biology.

Over the past decades, single-molecule and super-resolution microscopy have advanced and represent essential tools for life science research. There is,however, a growing gap between the state-of-the-art and what is accessible to biologists, biochemists, medical researchers or labs with financial constraints. To bridge this gap, we introduce Brick-MIC, a versatile and affordable open-source 3D-printed micro-spectroscopy and imaging platform. Brick-MIC enables the integration of various fluorescence imaging techniques with single-molecule resolution within a single platform and exchange between different modalities within minutes. We here present variants of Brick-MIC that facilitate single-molecule fluorescence detection, fluorescence correlation spectroscopy and super-resolution imaging (STORM and PAINT). Detailed descriptions of the hardware and software components, as well as data analysis routines are provided, to allow non-optics specialist to operate their own Brick-MIC with minimal effort and investments. We foresee that our affordable, flexible, and opensource Brick-MIC platform will be a valuable tool for many laboratories worldwide.

ABSTRACT Biomolecular structures are typically determined using frozen or crystalline samples. Measurement of intramolecular distances in solution can provide additional insights into conformational heterogeneity and dynamics of biological macromolecules and their complexes. The established molecular ruler techniques used for this (NMR, FRET, and EPR) are, however, limited in their dynamic range and require model assumptions to determine absolute distance (distributions). Here, we introduce anomalous X-ray scattering interferometry (AXSI) for intramolecular distance measurements in proteins, which are labeled at two sites with small gold nanoparticles of 0.7 nm radius. We apply AXSI to two different cysteine-variants of maltose binding protein in the presence and absence of its ligand maltose and find distances in quantitative agreement with single-molecule FRET experiments. Our study shows that AXSI enables determination of absolute intramolecular distance distributions under virtually arbitrary solution conditions and we anticipate its broad use to characterize protein conformational ensembles and dynamics.