Summary Long noncoding RNAs (lncRNAs) represent a multidimensional class of regulatory molecules involved in many aspects of brain function. Emerging evidence indicates that lncRNAs are expressed at the synapse; however, a direct role for their activity in this subcellular compartment in memory formation has yet to be demonstrated. Using lncRNA capture-seq on synaptosomes, we identified a significant number of lncRNAs that accumulate at synapses within the infralimbic prefrontal cortex of adult male C57/Bl6 mice. Among these is a splice variant related to the stress-associated lncRNA, Gas5. RNA immunoprecipitation followed by mass spectrometry and single molecule imaging revealed that this Gas5 isoform, in association with the RNA binding proteins G3bp2 and Caprin1, regulates the activity-dependent trafficking and clustering of RNA granules in dendrites. In addition, we found that cell-type-specific, state-dependent, and synapse-specific knockdown of the Gas5 variant led to impaired fear extinction memory. These findings identify a new mechanism of fear extinction that involves the dynamic interaction between local lncRNA activity and the coordination of RNA condensates in the synaptic compartment.

In this communication, we explored the synthesis of novel alkoxy-functionalised dihydropyrimido[4,5-

1 Abstract The endogenous opioid system modulates diverse functions including pain, physiological functions and motivation. We had earlier demonstrated an increase in cell proliferation in the neurogenic niche of adult male zebra finches, following administration of the general opioid antagonist, naloxone. Since the mechanisms underlying opioid modulation of neurogenesis are poorly understood, we have investigated the molecular mechanisms underlying cell proliferation differentiation induced by the opioid system. Systemic naloxone or vehicle administration in adult male birds was followed by a whole transcriptome microarray assay of the ventricular-subventricular zone (V-SVZ). The analysis revealed 26 differentially expressed transcripts (expression fold change ≥ 1.5), encoding genes important for neuronal functions. The transcriptomics analysis using microarray identified a significant increase in the expression of precursor miRNA tgu-mir-124-201 transcript following inhibition of opioid receptors by naloxone. Our results suggested that the administration of naloxone triggers an increase in the expression of the pro-differentiating microRNA, miR-124, in the brains of adult zebra finches. Using quantitative real-time PCR, we found that the expression of miR-124-3p was higher in the V-SVZ of naloxone-treated versus control birds. Furthermore, the density of neuroblasts was higher in the ventral V-SVZ adjacent to the striatal nucleus Area X, but not in the V-SVZ above the pallial nucleus, HVC, both of which are involved in singing. Since miR-124 targets signalling pathways important for neuronal proliferation and differentiation, our findings suggest that microRNA-124 may be involved in the increase in neurogenesis in adult songbirds induced by altering opioid modulation.

Abstract Investigating the RNA regulation landscape primarily relies on our understanding of how RNA-protein interactions are governed in various cell types, including neurons. Analysis of RNA-protein interactions in physiological environments warrants the development of new tools that rely on RNA manipulation. Recently, A CRISPR-based RNA-editing tool (dCas13b-ADAR2 DD ) was developed to mitigate disease associated point mutations in cell lines. Here, we have explored the targeted sequence editing potential of the tool (dCas13b-ADAR2 DD system) by adapting it to manipulate RNA function with an aim to visualize RNA editing in primary hippocampal neurons. This is a two-component system that includes a programmable guide RNA (gRNA) complementary to the target RNA, and a catalytically dead version of the Cas13b enzyme fused to ADAR. The RNA editing protocol outlined in this manuscript relies on using the gRNA-dependent targeting of dCas13b-ADAR fusion protein to the mutant form of mDendra transcript. We first abrogated the fluorescence of Dendra2 by introducing a nonsense mutation that precludes the formation of the functional protein. To visualize the efficacy of the RNA editing in neurons, we used the dCas13b-ADAR2 DD system to edit specific nucleotides within the Dendra2 mRNA to restore the amino acid codes critical for Dendra2 fluorescence. This method therefore lays the foundation to future studies on the dynamicity of activity-induced RNA-protein interactions in neurons and can be extended to manipulate the endogenous RNome in diverse neuronal subtypes. Furthermore, this methodology will enable investigators to visualize the spatial and temporal resolution of RNA-protein interactions without altering the genomes via conventional methods. Highlights CRISPR-Cas13 based application that enables site specific A-to-I in target RNAs directed by gRNA; optimized in neurons. Enables the temporal mapping of developmentally relevant RNAs and their cis-interacting RNA binding proteins.

Abstract Neurogenesis in the hypothalamus upon high fat diet (HFD) feeding regulates the feeding circuit. HFD induces the neurogenesis of β2 tanycytes in young-adult mice. However molecular mechanisms of tanycytic neurogenesis; and their functional integration into the feeding circuitry are poorly understood. We investigated the role of miRNAs in the regulation of HFD-induced tanycytic neurogenesis. miRNA arrays identified a cohort of HFD-induced, differentially-regulated miRNAs in BrdU + β2-tanycytes. These miRNAs arise from different chromosomes, rather than a single cluster. In silico network analysis on the predicted targets of all five HFD-induced miRNAs and reporter assays identified a subset of targets that influence neurogenesis and neuronal differentiation. HFD-induced miRNAs drive a molecular program leading to the functional integration of nascent neurons; introduction of a miRNA sponge sequestering all five miRNAs abolishes it. Diet-regulated newborn neurons preferentially differentiate into AgRP+ neurons that functionally integrate into the feeding circuit.

To survive aneuploidy-induced proteotoxic stress, cancer cells activate the proteotoxic-stress response pathway, which is controlled by heat shock factor 1 (HSF1). This pathway supports cancer initiation, cancer progression and chemoresistance and thus is an attractive target. As developing HSF1 inhibitors is challenging, the identification and targeting of upstream regulators of HSF1 presents a tractable alternative strategy. Here we demonstrate that in triple negative breast cancer (TNBC) cells, the dual-specificity tyrosine-regulated kinase 2 (DYRK2) phosphorylates HSF1, promoting its nuclear stability and transcriptional activity. Thus, DYRK2 depletion reduces HSF1 activity and sensitises TNBC cells to proteotoxic stress. Importantly, in tumours from TNBC patients, DYRK2 levels positively correlate with active HSF1 and associates with poor prognosis, suggesting that DYRK2 could be promoting TNBC. In agreement with this, DYRK2 depletion reduces tumour growth in a TNBC xenograft model. These findings identify DYRK2 as both, a key modulator of the HSF1 transcriptional program, and a potential therapeutic target.

Homeostatic scaling in neurons involve substantial proteome remodelling. Although dynamic changes to the proteome have been attributed to either translational or degradative control individually, there remains a lack of insight towards understanding how the interplay between translation and degradation modules effectuate cellular proteostasis during scaling. Here, we report that a mutual co-dependence of the two apparatus drive synaptic homeostasis in an RNA-dependent manner. We observed that abrogation of either translation or proteasomal activity prevents homeostasis and delineated the spatial features of their association. Members of the translation apparatus such as eIF4E, active forms of p70S6 kinase and miRISC-associated MOV10 were found to remain spatially linked with subunits of the catalytically active 26S proteasome subunits such as Rpt1, Rpt3, Rpt6, α7 and E3 ligase Trim32 on polysomes. We identified that paradigms of chronic downscaling involve miRISC remodelling and entails the degradation of MOV10 via the mTOR-dependent translation of Trim32. miRISC remodelling alone is sufficient to invoke downscaling through the removal of post-synaptic AMPA receptors. Our finding proposes a multifaceted model, where synaptic scaling is regulated by compositional changes in the miRISC via protein-synthesis-driven protein degradation.

Abstract Regulation of microtubule cytoskeleton is fundamental for the development and maintenance of neuronal architecture. Recent studies have shown that regulated RNA processing is also critical for the establishment and maintenance of neural circuits. In a genetic screen using mechanosensory neurons of C. elegans , we identified a mutation in muscleblind-1 as a suppressor of loss of kinesin-13 family microtubule destabilizing factor klp-7 . Muscleblind-1(MBL-1) is an RNA-binding protein that regulates the splicing, localization, and stability of RNA. We found that mbl-1 is required cell-autonomously for axon growth and synapse formation in the posterior lateral microtubule (PLM) neuron. Loss of mbl-1 affects stability and plus-end-out organization of microtubules in the anterior process of PLM. These defects are also accompanied by abnormal axonal transport of the synaptic protein RAB-3 and loss of gentle touch sensation in mbl-1 mutant. Our data showed that mbl-1 is genetically epistatic to mec-7 (β tubulin) and mec-12 (a tubulin) for axon growth. The immunoprecipitation of MBL-1 pulls down the mec-7, mec-12 , and sad-1 mRNAs. Additionally, the mbl-1 mutants show a reduction in the level and stability of mec-7 and mec-12 transcripts. Independently, mbl-1 is epistatic to sad-1 for synapse formation. Our work elucidated a previously unknown link between RNA binding protein and cytoskeletal machinery for the development and maintenance of the nervous system.

Abstract Proteasome-addicted neoplastic malignancies present a considerable refractory and relapsed phenotype with patients exhibiting drug-resistance and high mortality rates. To counter this global problem, novel proteasome-based therapies are being developed. In the current study we extensively characterize TIR-199, a syrbactin-class proteasome inhibitor derived from a plant virulence factor of bacterium Pseudomonas syringae pv syringae. We report that TIR-199 is a potent constitutive and immunoproteasome inhibitor, capable of inducing cell death in multiple myeloma, triple-negative breast cancer and non-small cell lung cancer lines, effectively inhibit proteasome in primary myeloma cells of refractory patients, and bypass the PSMB5 A49T+A50V bortezomib-resistant mutant. TIR-199 treatment leads to accumulation of canonical proteasome substrates in cells, it is specific, and does not inhibit 50 other enzymes tested in vitro. The drug exhibits synergistic cytotoxicity in combination with proteasome-activating-kinase DYRK2 inhibitor LDN192960. Furthermore, low dose TIR-199 exhibits in vivo activity in delaying myeloma-mediated bone degeneration in a mouse xenograft model. Together, our data indicates that proteasome inhibitor TIR-199 could indeed be a next generation drug within the repertoire of proteasome-based therapeutics with a potential to target relapsed and refractory proteasome-addicted neoplasia.

Abstract The abscopal effect is a phenomenon wherein localised therapy on the primary tumour leads to regression of distal metastatic growths. Interestingly, various pre-clinical studies utilising sonodynamic therapy (SDT) have reported significant abscopal effects, however, the mechanism remains largely enigmatic. SDT is an emerging non-invasive cancer treatment that uses focussed ultrasound (FUS) and a sonosensitiser to induce tumour cell death. To expand our understanding of abscopal effects of SDT, we have summarised the preclinical studies that have found SDT-induced abscopal responses across various cancer models, using diverse combination strategies with nanomaterials, microbubbles, chemotherapy, and immune checkpoint inhibitors. Additionally, we shed light on the molecular and immunological mechanisms underpinning SDT-induced primary and metastatic tumour cell death, as well as the role and efficacy of different sonosensitisers. Notably, the observed abscopal effects underscore the need for continued investigation into the SDT-induced ‘vaccine-effect’ as a potential strategy for enhancing systemic anti-tumour immunity and combating metastatic disease. The results of the first SDT human clinical trials are much awaited and are hoped to enable the further evaluation of the safety and efficacy of SDT, paving the way for future studies specifically designed to explore the potential of translating SDT-induced abscopal effects into clinical reality.