Summary Repair of DNA double strand breaks by the non-homologous end-joining pathway is initiated by the binding of Ku to DNA ends. Given its high affinity for ends, multiple Ku proteins load onto linear DNAs in vitro. However, in cells, Ku loading is limited to ∼1-2 molecules per DNA end. The mechanisms enforcing this limit are currently unknown. Here we show that the catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs), but not its protein kinase activity, is required to prevent excessive Ku entry into chromatin. Ku accumulation is further restricted by two mechanisms: a neddylation/FBXL12-dependent process which actively removes loaded Ku molecules throughout the cell cycle and a CtIP/ATM-dependent mechanism which operates in S-phase. Finally, we demonstrate that the misregulation of Ku loading leads to impaired transcription in the vicinity of DNA ends. Together our data shed light on the multiple layers of coordinated mechanisms operating to prevent Ku from invading chromatin and interfering with other DNA transactions. Highlights DNA-PKcs structurally blocks Ku sliding into chromatin in human & Xenopus A neddylation/FBXL12-dependent mechanism limits Ku accumulation on chromatin In S-phase, ATM/CtIP overcomes Ku accumulation In absence of DNA-PKcs, transcription at the DNA end vicinity is inhibited eTOC blurb The DNA end binding protein Ku can slide onto naked DNA but this is limited in cells. Using human cells and Xenopus egg extracts, DNA-PKcs is identified as the main structural barrier to Ku entry into chromatin, along with two active mechanisms which limit Ku accumulation in absence of DNA-PKcs. Graphical abstract

G-quadruplexes (G4), non-canonical DNA structures, are involved in several essential processes. Stabilization of G4 structures by small compounds (G4 ligands) affects almost all DNA transactions, including telomere maintenance and genomic stability. Here, thanks to a powerful and unbiased genetic approach, we identify topoisomerase 2-alpha (TOP2A) as the main effector of cell cytotoxicity induced by CX5461, a G4 ligand currently undergoing phase I/II clinical trials. This approach also allowed to identify new point mutations affecting TOP2A activity without compromising cell viability. Moreover, based on cross-resistance studies and siRNA-based protein depletion we report that TOP2A plays a major role in cell cytotoxicity induced by two unrelated clastogenic G4 ligands, CX5461 and pyridostatin (PDS). We also report that cytotoxic effects induced by both compounds are associated with topoisomerase 2-mediated DNA breaks production. Finally, we show that TOP2-mediated DNA breaks production is strongly associated with RNA Pol II-dependent transcription and is countered by topoisomerase 1 (TOP1). Altogether our results indicate that clastogenic G4 ligands act as DNA structure-driven TOP2-poisons at transcribed regions bearing G-quadruplex structures.