We report the development and initial experimental validation of a computational design procedure aimed at generating enzyme-like protein catalysts called “protozymes.” Our design approach utilizes a “compute and build” strategy that is based on the physical/chemical principles governing protein stability and catalytic mechanism. By using the catalytically inert 108-residue Escherichia coli thioredoxin as a scaffold, the histidine-mediated nucleophilic hydrolysis of p -nitrophenyl acetate as a model reaction, and the ORBIT protein design software to compute sequences, an active site scan identified two promising catalytic positions and surrounding active-site mutations required for substrate binding. Experimentally, both candidate protozymes demonstrated catalytic activity significantly above background. One of the proteins, PZD2, displayed “burst” phase kinetics at high substrate concentrations, consistent with the formation of a stable enzyme intermediate. The kinetic parameters of PZD2 are comparable to early catalytic Abs. But, unlike catalytic Ab design, our design procedure is independent of fold, suggesting a possible mechanism for examining the relationships between protein fold and the evolvability of protein function.

The genes of all organisms have been shaped by selective pressures. The relationship between gene sequence and fitness has tremendous implications for understanding both evolutionary processes and functional constraints on the encoded proteins. Here, we have exploited deep sequencing technology to experimentally determine the fitness of all possible individual point mutants under controlled conditions for a nine-amino acid region of Hsp90. Over the past five decades, limited glimpses into the relationship between gene sequence and function have sparked a long debate regarding the distribution, relative proportion, and evolutionary significance of deleterious, neutral, and advantageous mutations. Our systematic experimental measurement of fitness effects of Hsp90 mutants in yeast, evaluated in the light of existing population genetic theory, are remarkably consistent with a nearly neutral model of molecular evolution.

The amino acid sequence of a protein governs its function. We used bulk competition and focused deep sequencing to investigate the effects of all ubiquitin point mutants on yeast growth rate. Many aspects of ubiquitin function have been carefully studied, which enabled interpretation of our growth analyses in light of a rich structural, biophysical and biochemical knowledge base. In one highly sensitive cluster on the surface of ubiquitin, almost every amino acid substitution caused growth defects. In contrast, the opposite face tolerated virtually all possible substitutions. Surface locations between these two faces exhibited intermediate mutational tolerance. The sensitive face corresponds to the known interface for many binding partners. Across all surface positions, we observe a strong correlation between burial at structurally characterized interfaces and the number of amino acid substitutions compatible with robust growth. This result indicates that binding is a dominant determinant of ubiquitin function. In the solvent-inaccessible core of ubiquitin, all positions tolerated a limited number of substitutions, with hydrophobic amino acids especially interchangeable. Some mutations null for yeast growth were previously shown to populate folded conformations indicating that, for these mutants, subtle changes to conformation caused functional defects. The most sensitive region to mutation within the core was located near the C-terminus that is a focal binding site for many critical binding partners. These results indicate that core mutations may frequently cause functional defects through subtle disturbances to structure or dynamics.

Abstract Coronaviruses, as exemplified by SARS-CoV-2, can evolve and spread rapidly to cause severe disease morbidity and mortality. Direct acting antivirals (DAAs) are highly effective in decreasing disease burden especially when they target essential viral enzymes, such as proteases and polymerases, as demonstrated in HIV-1 and HCV and most recently SARS-CoV-2. Optimization of these DAAs through iterative structure-based drug design has been shown to be critical. Particularly, the evolutionarily conserved molecular mechanisms underlying viral replication can be leveraged to develop robust antivirals against rapidly evolving viral targets. The main protease (M pro ) of SARS-CoV-2, which is evolutionarily constrained to recognize and cleave 11 specific sites to promote viral maturation, exemplifies one such target. In this study we define the substrate envelope of M pro by determining the molecular basis of substrate recognition, through nine high-resolution cocrystal structures of SARS-CoV-2 M pro with the viral cleavage sites. These structures enable identification of evolutionarily vulnerable sites beyond the substrate envelope that may be susceptible to drug resistance and compromise binding of the newly developed M pro inhibitors.

ABSTRACT Gene-environment interactions have long been theorized to influence molecular evolution. However, the environmental dependence of most mutations remains unknown. Using deep mutational scanning, we engineered yeast with all 44,604 single codon changes encoding 14,160 amino acid variants in Hsp90 and quantified growth effects under standard conditions and under five stress conditions. To our knowledge these are the largest determined comprehensive fitness maps of point mutants. The growth of many variants differed between conditions, indicating that environment can have a large impact on Hsp90 evolution. Multiple variants provided growth advantages under individual conditions, however these variants tended to exhibit growth defects in other environments. The diversity of Hsp90 sequences observed in extant eukaryotes preferentially contains variants that supported robust growth under all tested conditions. Rather than favoring substitutions in individual conditions, the long-term selective pressure on Hsp90 may have been that of fluctuating environments, leading to robustness under a variety of conditions.

Abstract Allosteric regulation is central to protein function in cellular networks 1 . However, despite technological advances 2,3 most studies of allosteric effects on function are conducted in heterologous environments 2,4,5 , limiting the discovery of allosteric mechanisms that rely on endogenous binding partners or posttranslational modifications to modulate activity. Here we report an approach that enables probing of new sites of allosteric regulation at residue-level resolution in essential eukaryotic proteins in their native biological context by comprehensive mutational scanning. We apply our approach to the central GTPase Gsp1/Ran. GTPases are highly regulated molecular switches that control signaling, with switching occurring via catalyzed GTP hydrolysis and nucleotide exchange. We find that 28% of 4,315 assayed mutations in Gsp1/Ran are highly deleterious, showing a toxic response identified by our assay as gain-of-function (GOF). Remarkably, a third of all positions enriched for GOF mutations (20/60) are outside the GTPase active site. Kinetic analysis shows that these distal sites are allosterically coupled to the active site, including a novel cluster of sites that alter the nucleotide preference of Gsp1 from GDP to GTP. We describe multiple distinct mechanisms by which allosteric mutations alter Gsp1/Ran cellular function by modulating GTPase switching. Our systematic discovery of new regulatory sites provides a functional map relevant to other GTPases such as Ras that could be exploited for targeting and reprogramming critical biological processes.

Abstract With the continual evolution of new strains of SARS-CoV-2 that are more virulent, transmissible, and able to evade current vaccines, there is an urgent need for effective anti-viral drugs. SARS-CoV-2 main protease (M pro ) is a leading target for drug design due to its conserved and indispensable role in the viral life cycle. Drugs targeting M pro appear promising but will elicit selection pressure for resistance. To understand resistance potential in M pro , we performed a comprehensive mutational scan of the protease that analyzed the function of all possible single amino acid changes. We developed three separate high-throughput assays of M pro function in yeast, based on either the ability of M pro variants to cleave at a defined cut-site or on the toxicity of their expression to yeast. We used deep sequencing to quantify the functional effects of each variant in each screen. The protein fitness landscapes from all three screens were strongly correlated, indicating that they captured the biophysical properties critical to M pro function. The fitness landscapes revealed a non-active site location on the surface that is extremely sensitive to mutation making it a favorable location to target with inhibitors. In addition, we found a network of critical amino acids that physically bridge the two active sites of the M pro dimer. The clinical variants of M pro were predominantly functional in our screens, indicating that M pro is under strong selection pressure in the human population. Our results provide predictions of mutations that will be readily accessible to M pro evolution and that are likely to contribute to drug resistance. This complete mutational guide of M pro can be used in the design of inhibitors with reduced potential of evolving viral resistance.

Abstract Most of the fundamental processes of cells are mediated by proteins. However, the biologically- relevant mechanism of most proteins are poorly understood. Dominant negative mutations have provided a valuable tool for investigating mechanism, but can be difficult to isolate because of their toxic effects. We used a mutational scanning approach to identify dominant negative mutations in yeast Hsp90. Hsp90 is a chaperone that forms dynamic complexes with many co- chaperones and client proteins. In vitro analyses have elucidated some key biochemical states and structures of Hsp90, co-chaperones, and clients; however, the biological mechanism of Hsp90 remains unclear. For example, high throughput studies have found that many E3 ubiquitin ligases bind to Hsp90, but it is unclear if these are primarily clients or acting to tag other clients for degradation. Our analysis of all point mutations in Hsp90 identified 205 that dramatically slowed the growth of yeast harboring a second WT copy of Hsp90. 75% of the dominant negative mutations that we identified were located in a loop that closes over bound ATP. We analyzed a small panel of individual dominant mutations in this loop in detail. In this panel, addition of the E33A mutation that prevents ATP hydrolysis by Hsp90 abrogated the dominant negative phenotype. Pull-down experiments did not reveal any stable binding partners, indicating that the dominant effects were mediated by dynamic complexes. We examined the stability to proteolysis of glucocorticoid receptor (GR) as a model Hsp90 substrate. Upon expression of dominant negative Hsp90 variants, GR was rapidly destabilized in a proteasome-dependent fashion. These findings provide evidence that the binding of E3 ligases to Hsp90 may serve a quality control function fundamental to eukaryotes.

The appearance and spread of mutations that cause drug resistance in rapidly evolving diseases, including infections by SARS-CoV-2 virus, are major concerns for human health. Many drugs target enzymes, and resistant mutations impact inhibitor binding and/or enzyme activity. The most widely used inhibitors currently used to treat SARS-CoV-2 infections, including nirmatrelvir, target the main protease (Mpro) preventing it from processing viral polyproteins into active subunits. Previous work has systematically analyzed resistance mutations in Mpro that reduce binding to inhibitors, and here we investigate mutations that affect enzyme function. Hyperactive mutations that increase Mpro activity can contribute to drug resistance both directly by requiring elevated inhibitor concentrations to reduce function to critical levels and indirectly by increasing tolerance to mutations that reduce both substrate turnover and inhibitor binding. We comprehensively assessed how all possible individual mutations in Mpro affect enzyme function using a mutational scanning approach with a FRET-based yeast readout. We identified hundreds of mutations that significantly increased Mpro activity. Hyperactive mutations occurred both proximal and distal to the active site, consistent with protein stability and/or dynamics impacting activity. Hyperactive mutations were observed three times more than mutations that reduced apparent binding to nirmatrelvir in laboratory grown viruses selected for drug resistance and were also about three times more prevalent than nirmatrelvir binding mutations in sequenced isolates from circulating SARS-CoV-2. Our findings indicate that hyperactive mutations are likely to contribute to the natural evolution of drug resistance in Mpro and provide a comprehensive list for future surveillance efforts.

Abstract The infectivity of HIV-1 requires its protease cleave multiple cut-sites with low sequence similarity. The diversity of cleavage sites has made it challenging to investigate the underlying sequence properties that determine binding and turnover of substrates by PR. We engineered a mutational scanning approach utilizing yeast display, flow cytometry, and deep sequencing to systematically measure the impacts of all individual amino acid changes at 12 positions in three different cut-sites (MA/CA, NC/p1, and p1/p6). The resulting fitness landscapes revealed common physical features that underlie cutting of all three cut-sites at the amino acid positions closest to the scissile bond. In contrast, positions more than two amino acids away from the scissile bond exhibited a strong dependence on the sequence background of the rest of the cut-site. We observed multiple amino acid changes in cut-sites that led to faster cleavage rates, including a preference for negative charge five and six amino acids away from the scissile bond at locations where the surface of protease is positively charged. Analysis of individual cut sites using full-length matrix-capsid proteins indicate that long-distance sequence context can contribute to cutting efficiency such that analyses of peptides or shorter engineered constructs including those in this work should be considered carefully. This work provides a framework for understanding how diverse substrates interact with HIV-1 protease and can be extended to investigate other viral proteases with similar properties.