Abstract The protozoan parasite Leishmania donovani causes fatal human visceral leishmaniasis in absence of treatment. Genome instability has been recognized as a driver in Leishmania fitness gain in response to environmental change or chemotherapy. How genome instability generates beneficial phenotypes despite potential deleterious gene dosage effects is unknown. Here we address this important open question applying experimental evolution and integrative systems approaches on parasites adapting to in vitro culture. Phenotypic analyses of parasites from early and late stages of culture adaptation revealed an important fitness tradeoff, with selection for accelerated growth in promastigote culture (fitness gain) impairing infectivity (fitness costs). Comparative genomics, transcriptomics and proteomics analyses revealed a complex regulatory network driving parasite fitness, with genome instability causing highly reproducible, gene dosage-dependent changes in protein abundance linked to post-transcriptional regulation. These in turn were associated with a gene dosage-independent reduction in abundance of flagellar transcripts and a coordinated increase in abundance of coding and non-coding RNAs implicated in ribosomal biogenesis and protein translation. We correlated differential expression of small nucleolar RNAs (snoRNAs) with changes in rRNA modification, providing first evidence that Leishmania fitness gain in culture may be controlled by post-transcriptional and epitranscriptomic regulation. Our findings propose a novel model for Leishmania fitness gain in culture, where differential regulation of mRNA stability and the generation of fitness-adapted ribosomes may potentially filter deleterious from beneficial gene dosage effects and provide proteomic robustness to genetically heterogenous, adapting parasite populations. This model challenges the current, genome-centric approach to Leishmania epidemiology and identifies the Leishmania transcriptome and non-coding small RNome as potential novel sources for the discovery of biomarkers that may be associated with parasite phenotypic adaptation in clinical settings.

Abstract The fundamental value of universal nomenclatural systems in biology is that they enable unambiguous scientific communication. However, the stability of these systems is threatened by recent discussions asking for a fairer nomenclature, raising the possibility of bulk revision processes for “inappropriate” names. It is evident that such proposals come from very deep feelings, but we show how they can irreparably damage the foundation of biological communication and, in turn, the sciences that depend on it. There are four essential consequences of objective codes of nomenclature: universality, stability, neutrality, and transculturality. These codes provide fair and impartial guides to the principles governing biological nomenclature and allow unambiguous universal communication in biology. Accordingly, no subjective proposals should be allowed to undermine them.

Summary Differentiation between distinct stages is fundamental for the life cycle of intracellular protozoan parasites and for transmission between hosts, requiring stringent spatial and temporal regulation. Here we applied kinome-wide gene deletion and gene tagging in Leishmania mexicana promastigotes to define protein kinases with life cycle transition roles. Whilst 162 were dispensable, 44 protein kinase genes were refractory to deletion in promastigotes and are likely core genes required for parasite replication. Phenotyping of pooled gene deletion mutants using bar-seq and projection pursuit clustering revealed functional phenotypic groups of protein kinases involved in differentiation from metacyclic promastigote to amastigote, growth and survival in macrophages and mice, colonisation of the sand fly and motility. This unbiased interrogation of protein kinase function in Leishmania allows targeted investigation of organelle-associated signalling pathways required for successful intracellular parasitism.

Abstract Leishmania species, members of the kinetoplastid parasites, cause leishmaniasis, a neglected tropical disease, in millions of people worldwide. Leishmania has a complex life cycle with multiple developmental forms, as it cycles between a sand fly vector and a mammalian host; understanding their life cycle is critical to understanding disease spread. One of the key life cycle stages is the haptomonad form, which attaches to insect tissues through its flagellum. This adhesion, conserved across kinetoplastid parasites, is implicated in having an important function within their life cycles and hence in disease transmission. Here, we discover the kinetoplastid-insect adhesion proteins (KIAPs), which localise in the attached Leishmania flagellum. Deletion of these KIAPs impairs cell adhesion in vitro and prevents Leishmania from colonising the stomodeal valve in the sand fly, without affecting cell growth. Additionally, loss of parasite adhesion in the sand fly results in reduced physiological changes to the fly, with no observable damage of the stomodeal valve and reduced midgut swelling. These results provide important insights into a comprehensive understanding of the Leishmania life cycle, which will be critical for developing transmission-blocking strategies.

Abstract Leishmaniasis is widely regarded as a vaccine-preventable disease, but the costs required to reach pivotal Phase 3 studies and uncertainty about which candidate vaccines should be progressed into human studies significantly limits progress in vaccine development for this neglected tropical disease. Controlled human infection models (CHIM) provide a pathway for accelerating vaccine development and to more fully understand disease pathogenesis and correlates of protection. Here, we describe the isolation, characterization and GMP manufacture of a new clinical isolate of Leishmania major . Two fresh isolates of L. major from Israel were initially compared by genome sequencing, in vivo infectivity and drug sensitivity in mice, and development and transmission competence in sand flies, allowing one ( L. major _MRC-02) to be selected for GMP production. This study addresses a major roadblock in the development of vaccines for leishmaniasis, providing a key resource for CHIM studies of sand fly transmitted cutaneous leishmaniasis.

Abstract The males of many species of New World Phlebotomines produce volatile terpenoid chemicals which have been shown in Lutzomyia longipalpis s.l. and L. cruciata to be sex/aggregation pheromones which attract female and male conspecifics. Pheromone is produced in secretory cells surrounding a cuticular reservoir which collects the pheromone and passes it through a cuticular duct to the surface of the insect. On the surface the pheromone passes through a specialised structure prior to evaporation. The shape and distribution of the structures are highly diverse and differ according to species. They range in appearance from slightly raised domes (papules) to almost spherical apple shaped structures to slight depressions with central spikes and all with a central pore. They can occur either singly or in many hundreds distributed on most abdominal tergites or grouped on one. The pheromone secreting apparatus in sand flies and other insects have historically been examined from the exterior using scanning electron microscopy (SEM) and from the interior using transmission electron microscopy. In this study we used SEM to examine the interior cuticular structure of 3 members of the Lutzomyia longipalpis s.l. species complex and Migonemyia migonei and found a new structure associated with pheromone release which we have called the Manifold. The Manifold is a substantial structure siting in-line between the cuticular duct and the underside of the tergite. Differences in the size and shape of the Manifold may be related to the chemical structure of the pheromone. In addition to the importance of this hitherto unknown structure in the production, dissemination and ecology of the pheromone, as well as its potential taxonomic value, examination of the interior cuticle by SEM may help locate the secretory apparatus in important vector species where pheromonal activity has been inferred from behavioural studies but the external secretory structures or potential pheromones have not been found.

Abstract Many of the currently available anti-parasitic and anti-fungal frontline drugs have severe limitations, including adverse side effects, complex administration, and increasing occurrence of resistance. The discovery and development of new therapeutic agents is a costly and lengthy process. Therefore, repurposing drugs with already established clinical application offers an attractive, fast-track approach for novel treatment options. In this study, we show that the anti-cancer drug MitoTam, a mitochondria-targeted analog of tamoxifen, efficiently eliminates a wide range of evolutionarily distinct pathogens in vitro , including pathogenic fungi, Plasmodium falciparum , and several species of trypanosomatid parasites, causative agents of debilitating neglected tropical diseases. MitoTam treatment was also effective in vivo and significantly reduced parasitemia of two medically important parasites, Leishmania mexicana and Trypanosoma brucei , in their respective animal infection models. Functional analysis in the bloodstream form of T. brucei showed that MitoTam rapidly altered mitochondrial functions, particularly affecting cellular respiration, lowering ATP levels, and dissipating mitochondrial membrane potential. Our data suggest that the mode of action of MitoTam involves disruption of the inner mitochondrial membrane, leading to rapid organelle depolarization and cell death. Altogether, MitoTam is an excellent candidate drug against several important pathogens, for which there are no efficient therapies and for which drug development is not a priority. Author Summary MitoTam, a mitochondrially targeted analog of tamoxifen, is a promising anti-cancer candidate drug acting by accumulating in and destabilizing cell mitochondria. In this study, we analyze its effect on a wide range of evolutionarily distinct and medically important pathogens. These include a) pathogenic fungi, Candida albicans, and Cryptococcus neoformans, ubiquitous opportunistic pathogens that cause life-threatening diseases in immunocompromised or immunologically deficient individuals; b) Plasmodium falciparum , the causative agent of human malaria; and c) several species of trypanosomatid parasites such as Trypanosoma cruzi, responsible for deadly Chagas disease in South America, Trypanosoma brucei, the causative agent of sleeping sickness in Africa, and Leishmania, the etiological agent of leishmaniasis, a spectrum of diseases ranging from usually self-healing but potentially disfiguring cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis, to visceral leishmaniasis, which is invariably fatal if left untreated. We show that MitoTam efficiently kills these parasites in laboratory conditions and in the case of trypanosomes and leishmaniases suppress or at least slow down the infection in mouse model.

ABSTRACT Trypanosomatid pathogens are transmitted by blood-feeding insects, causing devastating human infections. Survival of these parasites in their vertebrate and invertebrate hosts relies on their capacity to differentiate into distinct stages that are the result of a co-evolutionary process. These stages show in addition important phenotypic shifts that often impacts infection, affecting for example parasite pathogenicity, tissue tropism, or drug susceptibility. Despite their clinical relevance, the evolutionary mechanisms that allow for the selection of such adaptive phenotypes remain only poorly investigated. Here we use Leishmania donovani as a trypanosomatid model pathogen to shed first light on parasite evolutionary adaptation during experimental sand fly infection. Applying a comparative genomics approach on hamster- isolated amastigotes and derived promastigotes before (input) and after (output) infection of Phlebotomus orientalis revealed a strong bottleneck effect on the parasite population as judged by principal component and phylogenetic analyses of input and output parasite DNA sequences. Despite random genetic drift caused by the bottleneck effect, our analyses revealed various genomic signals that seem under positive selection given their convergence between independent biological replicates. While no significant fluctuations in gene copy number were revealed between input and output parasites, convergent selection was observed for karyotype, haplotype and allelic changes during sand fly infection. Our analyses further uncovered signature mutations of oxidative DNA damage in the output parasite genomes, suggesting that Leishmania suffers from oxidative stress inside the insect digestive tract. Our results propose a new model of Leishmania genomic adaptation during sand fly infection, where oxidative DNA damage and DNA repair processes drive haplotype and allelic selection. The experimental and computational framework presented here provides a useful blueprint to assess evolutionary adaptation of other eukaryotic pathogens inside their insect vectors, such as Plasmodium spp, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi .

Abstract Attachment to a substrate to maintain position in a specific ecological niche is a common strategy across biology, especially for eukaryotic parasites. During development in the sand fly vector, the eukaryotic parasite Leishmania adheres to the stomodeal valve, as the specialised haptomonad form. Dissection of haptomonad adhesion is a critical step for understanding parasite transmission. Nevertheless, haptomonad studies are limited, as this is a technically challenging life cycle form to investigate. Here, we have combined three-dimensional electron microscopy approaches, including serial block face scanning electron microscopy (SBFSEM) and serial tomography to dissect the organisation and architecture of haptomonads in the sand fly. We showed that the attachment plaque contains distinct structural elements. Using time-lapse light microscopy, we identified five stages of haptomonad differentiation, and showed that calcium is necessary for haptomonad adhesion to the surface. This study provides the structural and regulatory foundations of the haptomonad form, which are critical for a holistic understanding of Leishmania transmission.

Leishmania species, members of the kinetoplastid parasites, cause leishmaniasis, a neglected tropical disease, in millions of people worldwide 1 . Leishmania has a complex life cycle with multiple developmental forms, as it cycles between a sand fly vector and a mammalian host; understanding their life cycle is critical to understanding disease spread 2 . One of the key life cycle stages is the haptomonad form, which is attached to the insect through its flagellum. This adhesion, which is conserved across kinetoplastid parasites, is implicated to have an important function within their life cycles and hence on disease transmission 3–5 . Here, we discovered kinetoplastid-insect adhesion proteins (KIAPs), which are localised in the attached haptomonad flagellum. Deletion of these KIAPs impaired cell adhesion in vitro and prevented Leishmania from colonising the stomodeal valve in the sand fly, without affecting cell growth. This result will provide important insights for a comprehensive understanding of the Leishmania life cycle.