Summary Bacterial evolution is affected by mobile genetic elements such as phages and conjugative plasmids, which may provide novel adaptive traits but also incur in fitness costs. Infection by these elements is affected by the bacterial capsule. Yet, its importance has been difficult to quantify and characterise because of the high diversity of bacterial genomes regarding confounding mechanisms such as anti-viral systems. We swapped capsule loci between Klebsiella pneumoniae strains to quantify their effect on transfer of conjugative plasmids and phages independently of the genetic background. Capsule swaps systematically invert phage susceptibility, demonstrating that serotypes are key determinants of phage infection. Capsule types also affect conjugation efficiency in both donor and recipient cells depending on the serotype, a mechanism shaped by the capsule volume and depending on the structure of the conjugative pilus. Comparative genomics confirmed that more permissive serotypes in the lab correspond to the strains acquiring more conjugative plasmids in nature. The pili least sensitive to capsules (F-like) are also the most frequent in the species’ plasmids, and are the only ones associated with both antibiotic resistance and virulence factors, driving the convergence between virulence and antibiotics resistance in the population. These results show how the traits of cellular envelopes define slow and fast lanes of infection by mobile genetic elements, with implications for population dynamics and horizontal gene transfer. Graphical abstract

Abstract Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria. Many of them produce specific enzymes called depolymerases to break down external polysaccharide structures. Accurate annotation and domain identification of these depolymerases are challenging due to their inherent sequence diversity. Hence, we present DepoScope, a machine learning tool that combines a fine-tuned ESM-2 model with a convolutional neural network to precisely identify depolymerase sequences and their enzymatic domains. To accomplish this, we curated a dataset from the INPHARED phage genome database, created a polysaccharide-degrading domain database, and applied sequential filters to construct a high-quality dataset, which are subsequently used to train DepoScope. Our work is the first approach that combines sequence-level predictions with amino-acid-level predictions for an accurate depolymerase detection and functional domain identification. In that way, we believe that DepoScope can enhance our understanding of phage-host interactions at the level of depolymerases. Summary with Key Messages Phage depolymerases are proteins that play a crucial role in the first step of a phage replication cycle. As a result, they are both important from a biological perspective and a therapeutical perspective. Current methods to accurately annotate phage depolymerases and their associated enzymatic domains remains challenging due to their inherent high sequence diversity. We have developed DepoScope, a language-based artificial intelligence model that can accurately identify phage depolymerases and their specific enzymatic domains. We provide full public access to the DepoScope code and database to give broad access to the research community and promote further research.

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria. Many of them produce specific enzymes called depolymerases to break down external polysaccharide structures. Accurate annotation and domain identification of these depolymerases are challenging due to their inherent sequence diversity. Hence, we present DepoScope, a machine learning tool that combines a fine-tuned ESM-2 model with a convolutional neural network to identify depolymerase sequences and their enzymatic domains precisely. To accomplish this, we curated a dataset from the INPHARED phage genome database, created a polysaccharide-degrading domain database, and applied sequential filters to construct a high-quality dataset, which is subsequently used to train DepoScope. Our work is the first approach that combines sequence-level predictions with amino-acid-level predictions for accurate depolymerase detection and functional domain identification. In that way, we believe that DepoScope can greatly enhance our understanding of phage-host interactions at the level of depolymerases.

Cystic fibrosis (CF) patients are prone to recurrent multi-drug-resistant (MDR) bacterial lung infections. Under this scenario, phage therapy has been proposed as a promising tool. However, the limited number of reported cases hampers the understanding of clinical outcomes. Anti-phage immune responses have often been overlooked and only described following invasive routes of administration.

ABSTRACT Integrons are bacterial genetic elements that capture, stockpile and modulate the expression of genes encoded in integron cassettes. Mobile Integrons (MI) are borne on plasmids, acting as a vehicle for hundreds of antimicrobial resistance genes among key pathogens. These elements also carry g ene c assettes of u nknown function ( gcu s) whose role and adaptive value remains unexplored. Recent years have witnessed the discovery of a myriad defense systems against bacteriophages, highlighting that viral infection is a major selective pressure for bacteria. We hence sought to explore if gcu s could encode phage defense systems. Using the INTEGRALL database, we established a collection of 129 gcu s in pMBA, a vector where cassettes are established as part of a class 1 integron. PADLOC and DefenseFinder predicted four phage defense systems in this collection, comprising Lamassu, CBASS and two ABI (abortive infection) systems. We experimentally challenged all cassettes with phages and found eleven additional candidates that were not detected in silico . We have characterized in depth the 15 gcu s against a panel of phages in Escherichia coli confirming their role as p hage defense integron c assettes (PICs). We used recombination assays to verify that these are bona fide integron cassettes and are therefore mobile. We show that PICs confer resistance in other clinically relevant species, such as Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. Several PICs also limit prophage activation, providing protection at the population-level. Given the stockpiling capacity of integrons, we explored the additivity of phenotypes and found that integrons with two PICs confer multiphage-resistance. Additionally, when combined with antimicrobial resistance genes, integrons confer simultaneously drug and phage resistance. Crucially, we also show that the position of a pic in the array can strongly decrease its cost. Our results prove a role of integrons in phage defense, acting as highly mobile, low-cost defense islands.

Viral entry is a critical step in the infection process. Klebsiella spp. and other clinically relevant bacteria often express a complex polysaccharide capsule that acts as a barrier to phage entry. In turn, most Klebsiella phages encode depolymerases for capsule removal. This virus-host arms race has led to extensive genetic diversity in both capsules and depolymerases, complicating our ability to understand their interaction. This study exploits the information encoded in Klebsiella prophages to model the interplay between the bacteria, the prophages, and their depolymerases, using a graph neural network and a sequence clustering-based method. Both approaches showed significant predictive ability for prophages capsular tropism and, importantly, were transferrable to lytic phages. In addition to creating a comprehensive database linking depolymerase sequences to their specific targets, this study demonstrates the predictability of phage-host interactions at the subspecies level, providing new insights for improving the therapeutic and industrial applicability of phages.

ABSTRACT Bacteriophages play key roles in bacterial ecology and evolution and are potential antimicrobials. However, the determinants of phage-host specificity remain elusive. Here, we used 46 newly-isolated phages to challenge 138 representative clinical isolates of Klebsiella pneumoniae , a widespread opportunistic pathogen. Spot tests revealed a narrow host range for most phages, with <2% of 6319 phage-host combinations tested yielding detectable interactions. Bacterial capsule diversity was the main factor restricting phage host range. Consequently, phage-encoded depolymerases were key determinants of host tropism, and we identified depolymerase sequence types associated with the ability to infect specific capsular types across phage families. Phages showing a capsule-independent mode of entry exhibited a much broader host range, but their infectivity was still restricted by complex intracellular defense mechanisms. These findings expand our knowledge of the complex interactions between bacteria and their viruses, and have implications for the biomedical and biotechnological use of phages.

Abstract Klebsiella pneumoniae is one of the most threatening multi-drug resistant pathogens today, with phage therapy being a promising alternative for personalized treatments. However, the intrinsic capsule diversity in Klebsiella spp. poses a substantial barrier to phage host range, complicating the development of broad-spectrum phage-based treatments. Here, we have isolated and genomically characterized phages capable of infecting each of the acquired 77 reference serotypes of Klebsiella spp ., including capsular types widespread among high-risk K. pneumoniae clones causing nosocomial infections. We demonstrated the possibility of isolating phages for all capsular types in the collection, revealing high capsular specificity among taxonomically related phages, in contrast to a few phages that exhibited broad-spectrum infection capabilities. To decipher the determinants of the specificity of these phages, we focused on their receptor-binding proteins, with particular attention to depolymerase domains. We also explored the possibility of designing a broad-spectrum phage cocktail based on phages isolated in reference capsular type strains, and determining the ability to lysate relevant clinical isolates. Interestingly, a combination of 12 phages capable of infecting 60% of the reference Klebsiella spp. serotypes was tested on a panel of carbapenem-resistant K. pneumoniae clinical isolates. Our results suggest that in a highly variable encapsulated bacterial host, phage hunting must be directed to the specific Klebsiella isolates. This work is a step forward in the understanding of the complexity of phage-host interactions, and highlights the importance of implementing precise and phage-specific strategies to treat K. pneumoniae infections worldwide.