Bacterial extracellular polysaccharides are a key constituent of the extracellular matrix material of biofilms. Pseudomonas aeruginosa is a model organism for biofilm studies and produces three extracellular polysaccharides that have been implicated in biofilm development, alginate, Psl and Pel. Significant work has been conducted on the roles of alginate and Psl in biofilm development, however we know little regarding Pel. In this study, we demonstrate that Pel can serve two functions in biofilms. Using a novel assay involving optical tweezers, we demonstrate that Pel is crucial for maintaining cell-to-cell interactions in a PA14 biofilm, serving as a primary structural scaffold for the community. Deletion of pelB resulted in a severe biofilm deficiency. Interestingly, this effect is strain-specific. Loss of Pel production in the laboratory strain PAO1 resulted in no difference in attachment or biofilm development; instead Psl proved to be the primary structural polysaccharide for biofilm maturity. Furthermore, we demonstrate that Pel plays a second role by enhancing resistance to aminoglycoside antibiotics. This protection occurs only in biofilm populations. We show that expression of the pel gene cluster and PelF protein levels are enhanced during biofilm growth compared to liquid cultures. Thus, we propose that Pel is capable of playing both a structural and a protective role in P. aeruginosa biofilms.

Aptamer advantages: Cell-specific delivery of the anticancer drug cisplatin through a nucleolin-aptamer-conjugated, cisplatin-encapsulating liposome delivery system is described. Calcein was incorporated into the target MCF-7 cells (see top image) but not into LNCaP cells (see bottom image). More importantly, the extent of delivery can be controlled by using a complementary DNA of the aptamer as an antidote. Detailed facts of importance to specialist readers are published as "Supporting Information". Such documents are peer-reviewed, but not copy-edited or typeset. They are made available as submitted by the authors. Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.

We explore the potential of nanocrystals (a term used equivalently to nanoparticles) as building blocks for nanomaterials, and the current advances and open challenges for fundamental science developments and applications. Nanocrystal assemblies are inherently multiscale, and the generation of revolutionary material properties requires a precise understanding of the relationship between structure and function, the former being determined by classical effects and the latter often by quantum effects. With an emphasis on theory and computation, we discuss challenges that hamper current assembly strategies and to what extent nanocrystal assemblies represent thermodynamic equilibrium or kinetically trapped metastable states. We also examine dynamic effects and optimization of assembly protocols. Finally, we discuss promising material functions and examples of their realization with nanocrystal assemblies.

Abstract During biofilm formation, the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa uses its type IV pili (TFP) to sense a surface, eliciting increased second messenger production and regulating target pathways required to adapt to a surface lifestyle. The mechanisms whereby TFP detect surface contact is still poorly understood, although mechanosensing is often invoked with little data supporting this claim. Using a combination of molecular genetics and single cell analysis, with biophysical, biochemical and genomics techniques we show that force-induced changes mediated by the von Willebrand A (vWA) domain-containing, TFP tip-associated protein PilY1 are required for surface sensing. Atomic force microscopy shows that PilY1 can undergo force-induced, sustained conformational changes akin to those observed for mechanosensitive proteins like titin. We show that mutation of a single cysteine residue in the vWA domain results in modestly lower surface adhesion forces, increased nanospring-like properties, as well as reduced c-di-GMP signaling and biofilm formation. Mutating this cysteine has allowed us to genetically separate TFP function in twitching from surface sensing signaling. The conservation of this Cys residue in all P. aeruginosa PA14 strains, and its absence in the ~720 sequenced strains of P. aeruginosa PAO1, could contribute to explaining the observed differences in surface colonization strategies observed for PA14 versus PAO1. Importance Most bacteria live on abiotic and biotic surfaces in surface-attached communities known as biofilms. Surface sensing and increased levels of the second messenger molecule c-di-GMP are crucial to the transition from planktonic to biofilm growth. The mechanism(s) underlying TFP-mediated surface detection that triggers this c-di-GMP signaling cascade are unclear. Here, we provide a key insight into this question: we show that the eukaryotic-like, vWA domain of the TFP tip-associated protein PilY1 responds to mechanical force, which in turn drives production of a key second messenger needed to regulate surface behaviors. Our studies highlight a potential mechanism that could account for differing surface colonization strategies.

Deterministic formation of membrane scission necks by protein machinery with multiplexed functions is critical in biology. A microbial example is M2 viroporin, a proton pump from the influenza A virus that is multiplexed with membrane remodeling activity to induce budding and scission in the host membrane during viral maturation. In comparison, the dynamin family constitutes a class of eukaryotic proteins implicated in mitochondrial fission, as well as various budding and endocytosis pathways. In the case of Dnm1, the mitochondrial fission protein in yeast, the membrane remodeling activity is multiplexed with mechanoenzyme activity to create fission necks. It is not clear why these functions are combined in these scission processes, which occur in drastically different compositions and solution conditions. In general, direct experimental access to changing neck sizes induced by individual proteins or peptide fragments is challenging due to the nanoscale dimensions and influence of thermal fluctuations. Here, we use a mechanical model to estimate the size of scission necks by leveraging small-angle X-ray scattering structural data of protein–lipid systems under different conditions. The influence of interfacial tension, lipid composition, and membrane budding morphology on the size of the induced scission necks is systematically investigated using our data and molecular dynamic simulations. We find that the M2 budding protein from the influenza A virus has robust pH-dependent membrane activity that induces nanoscopic necks within the range of spontaneous hemifission for a broad range of lipid compositions. In contrast, the sizes of scission necks generated by mitochondrial fission proteins strongly depend on lipid composition, which suggests a role for mechanical constriction.

Abstract To initiate biofilm formation it is critical for bacteria to sense a surface and respond precisely. Type 4 pili (T4P) have been shown to be important in surface sensing, however, mechanism(s) driving downstream changes important for the switch to biofilm growth have not been clearly defined. Here, using macroscopic bulk assays and single cell tracking analyses of Pseudomonas aeruginosa , we uncover a new role of the T4P alignment complex protein, PilO, in modulating the activity of the diguanylate cyclase (DGC) SadC. Two hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays show that PilO physically interacts with SadC and that the PilO-SadC interaction inhibits SadC’s activity resulting in decreased biofilm formation and increased motility. We show that disrupting the PilO-SadC interaction contributes to greater variation of cyclic-di-GMP levels among cells, thereby increasing cell-to-cell heterogeneity in the levels of this signal. Thus, this work shows that P. aeruginosa uses a component of the T4P scaffold to fine-tune the levels of this nucleotide signal during surface commitment. Finally, given our previous findings linking SadC to the flagellar machinery, we propose that this DGC acts as a bridge to integrate T4P and flagellar-derived input signals during initial surface engagement. Significance Statement T4P of P. aeruginosa are important for surface sensing and regulating intracellular cyclic-di-GMP levels. This work identifies a new role for the T4P alignment complex, previously known for its role in supporting pili biogenesis, in surface-dependent signaling. Furthermore, our findings indicate that P. aeruginosa uses a single DGC, via a complex web of protein-protein interactions, to integrate signaling through the T4P and the flagellar motor to fine-tune cyclic-di-GMP levels. A key implication of this work is that more than just regulating signal levels, cells must modulate the dynamic range of cyclic-di-GMP to precisely control the transition to a biofilm lifestyle.

Abstract During replication of herpesviruses, capsids escape from the nucleus into the cytoplasm by budding at the inner nuclear membrane. This unusual process is mediated by the viral nuclear egress complex (NEC) that deforms the membrane around the capsid by oligomerizing into a hexagonal, membrane-bound scaffold. Here, we found that highly basic membrane-proximal regions (MPRs) of the NEC alter lipid order by inserting into the lipid headgroups and also promote negative Gaussian curvature. We also find that the electrostatic interactions between the MPRs and the membranes are essential for membrane deformation. One of the MPRs is phosphorylated by a viral kinase during infection, and the corresponding phosphomimicking mutations block capsid nuclear egress. We show that the same phosphomimicking mutations disrupt the NEC/membrane interactions and inhibit NEC-mediated budding in vitro , providing a biophysical explanation for the in-vivo phenomenon. Our data suggest that the NEC generates negative membrane curvature by both lipid ordering and protein scaffolding and that phosphorylation acts as an “off” switch that inhibits the membrane-budding activity of the NEC to prevent capsid-less budding.

Swarming is a macroscopic phenomenon in which surface bacteria organize into a motile population. The flagellar motor that drives swarming in Pseudomonas aeruginosa is powered by stators MotAB and MotCD. Deletion of the MotCD stator eliminates swarming, whereas deletion of the MotAB stator enhances swarming. Interestingly, we measured a strongly asymmetric stator availability in the WT strain, with MotAB stators produced ∼40-fold more than MotCD stators. However, recruitment of MotCD stators in free swimming cells requires higher liquid viscosities, while MotAB stators are readily recruited at low viscosities. Importantly, we find that cells with MotCD stators are ∼10x more likely to have an active motor compared to cells without, so wild-type, WT, populations are intrinsically heterogeneous and not reducible to MotAB-dominant or MotCD-dominant behavior. The spectrum of motility intermittency can either cooperatively shut down or promote flagellum motility in WT populations. In P. aeruginosa , transition from a static solid-like biofilm to a dynamic liquid-like swarm is not achieved at a single critical value of flagellum torque or stator fraction but is collectively controlled by diverse combinations of flagellum activities and motor intermittencies via dynamic stator recruitment. Experimental and computational results indicate that the initiation or arrest of flagellum-driven swarming motility does not occur from individual fitness or motility performance but rather related to concepts from the 'jamming transition' in active granular matter.After extensive study, it is now known that there exist multifactorial influences on swarming motility in P. aeruginosa , but it is not clear precisely why stator selection in the flagellum motor is so important or how this process is collectively initiated or arrested. Here, we show that for P. aeruginosa PA14, MotAB stators are produced ∼40-fold more than MotCD stators, but recruitment of MotCD over MotAB stators requires higher liquid viscosities. Moreover, we find the unanticipated result that the two motor configurations have significantly different motor intermittencies, the fraction of flagellum-active cells in a population on average, with MotCD active ∼10x more often than MotAB. What emerges from this complex landscape of stator recruitment and resultant motor output is an intrinsically heterogeneous population of motile cells. We show how consequences of stator recruitment led to swarming motility, and how they potentially relate to surface sensing circuitry.

ABSTRACT Classically, chemokines coordinate leukocyte trafficking during immune responses; however, many chemokines have also been reported to possess direct antibacterial activity in vitro. Yet, the bacterial killing mechanism of chemokines and the biochemical properties that define which members of the chemokine superfamily are antimicrobial remain poorly understood. Here we report that the antimicrobial activity of chemokines is defined by their ability to bind phosphatidylglycerol and cardiolipin, two anionic phospholipids commonly found in the bacterial plasma membrane. We show that only chemokines able to bind these two phospholipids kill Escherichia coli and Staphylococcus aureus and that they exert rapid bacteriostatic and bactericidal effects against E. coli with a higher potency than the antimicrobial peptide beta-defensin 3. Furthermore, our data support that bacterial membrane cardiolipin facilitates the antimicrobial action of chemokines. Both biochemical and genetic interference with the chemokine-cardiolipin interaction impaired microbial growth arrest, bacterial killing, and membrane disruption by chemokines. Moreover, unlike conventional antibiotics, E. coli failed to develop resistance when placed under increasing antimicrobial chemokine pressure in vitro. Thus, we have identified cardiolipin and phosphatidylglycerol as novel binding partners for chemokines responsible for chemokine antimicrobial action. Our results provide proof of principle for developing chemokines as novel antibiotics resistant to bacterial antimicrobial resistance mechanisms.

Hopanoids are steroid-like bacterial lipids that enhance membrane rigidity and promote bacterial growth under diverse stresses. Hopanoid biosynthesis genes are conserved in nitrogen-fixing plant symbionts, and we previously found that the extended (C35) class of hopanoids in Bradyrhizobium diazoefficiens are required for efficient symbiotic nitrogen fixation in the tropical legume host Aeschynomene afraspera. Here we demonstrate that the nitrogen fixation defect conferred by extended loss can fully be explained by a reduction in root nodule sizes rather than per-bacteroid nitrogen fixation levels. Using a single nodule tracking approach to track A. afraspera nodule development, we provide a quantitative model of root nodule development in this host, uncovering both the baseline growth parameters for wild-type nodules and a surprising heterogeneity of extended hopanoid mutant developmental phenotypes. These phenotypes include a delay in root nodule initiation and presence of a subpopulation of nodules with slow growth rates and low final volumes, which are correlated with reduced motility and surface attachment in vitro and lower bacteroid densities in planta, respectively. This work provides a quantitative reference point for understanding the phenotypic diversity of ineffective symbionts in A. afraspera and identifies specific developmental stages affected by extended hopanoid loss for future mechanistic work.