We studied whether microalbuminuria (urinary albumin excretion rates of 15 to 150 micrograms per minute) would predict the development of increased proteinuria in Type I diabetes. We also studied the influence of glomerular filtration rate, renal blood flow, and blood pressure on the later development of proteinuria. Forty-four patients who had had Type I diabetes for at least seven years and who had albumin excretion rates below 150 micrograms per minute were studied from 1969 to 1976, and 43 were restudied in 1983. Of the 14 who initially had albumin excretion rates at or above 15 micrograms per minute, 12 had clinically detectable proteinuria (over 500 mg of protein per 24 hours) or an albumin excretion rate above 150 micrograms per minute at the later examination. Of the 29 who initially had albumin excretion rates below 15 micrograms per minute, none had clinically detectable proteinuria at the later examination, although four had microalbuminuria. Those whose condition progressed to clinically overt proteinuria had elevated glomerular filtration rates and higher blood pressures at the initial examination than did those in whom proteinuria did not develop. Renal blood flow was not elevated in these patients. We conclude that microalbuminuria predicts the development of diabetic nephropathy and that elevated glomerular filtration rates and increased blood pressure may also contribute to this progression.

OBJECTIVE--Correlation of the urinary albumin excretion rate and the risk of death among elderly subjects. DESIGN--216 Subjects aged 60-74 whose urinary albumin excretion rate had been determined were followed up 62-83 months later. SETTING--Municipality of Fredericia, Denmark. SUBJECTS--223 People who had been selected as control subjects for diabetics found during a systematic screening for diabetes of all people aged 60-74 living in the municipality of Fredericia, Denmark. Of these subjects, 216 had an extensive clinical and biochemical examination within a few weeks of selection. MAIN OUTCOME MEASURE--Death. RESULTS--The median urinary albumin excretion rate was 7.52 micrograms/min. Eight of those with a rate below the median died compared with 23 with a rate equal to or greater than the median (p = 0.0078). The median albumin excretion rate in the 31 who died was 15.00 micrograms/min. Cardiovascular disease was the most common cause of death in both groups. A multivariate regression analysis of survival data was performed using the proportional hazards model. Besides albumin excretion rate, male sex, serum creatinine concentration, and hypertension were found to be of prognostic value. CONCLUSIONS--The association between the albumin excretion rate and mortality that has been described in recent years in patients with diabetes mellitus may be present in elderly people in general, even when other known risk factors are taken into account.

Few data are available to clarify whether changes in albuminuria over time translate to changes in cardiovascular risk. The aim of the present study was to examine whether changes in albuminuria during 4.8 years of antihypertensive treatment were related to changes in risk in 8206 patients with hypertension and left ventricular hypertrophy in the Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension (LIFE) study. Urinary albumin/creatinine ratio (UACR) was measured at baseline and annually. Time-varying albuminuria was closely related to risk for the primary composite end point (ie, when UACR decreased during treatment, risk was reduced accordingly). When the population was divided according to median baseline value (1.21 mg/mmol) and median year 1 UACR (0.67 mg/mmol), risk increased stepwise and significantly for the primary composite end point from those with low baseline/low year 1 (5.5%), to low baseline/high year 1 (8.6%), to high baseline/low year 1 (9.4%), and to high baseline/high year 1 (13.5%) values. Similar significant, stepwise increases in risk were seen for the components of the primary composite end point (cardiovascular mortality, stroke, and myocardial infarction). The observation that changes in UACR during antihypertensive treatment over time translated to changes in risk for cardiovascular morbidity and mortality was not explained by in-treatment level of blood pressure. We propose that monitoring of albuminuria should be an integrated part of the management of hypertension. If albuminuria is not decreased by the patient's current antihypertensive and other treatment, further intervention directed toward blood pressure control and other modifiable risks should be considered.

In the Action in Diabetes and Vascular Disease: Preterax and Diamicron Modified Release Controlled Evaluation (ADVANCE) factorial trial, the combination of perindopril and indapamide reduced mortality among patients with type 2 diabetes, but intensive glucose control, targeting a glycated hemoglobin level of less than 6.5%, did not. We now report results of the 6-year post-trial follow-up.We invited surviving participants, who had previously been assigned to perindopril-indapamide or placebo and to intensive or standard glucose control (with the glucose-control comparison extending for an additional 6 months), to participate in a post-trial follow-up evaluation. The primary end points were death from any cause and major macrovascular events.The baseline characteristics were similar among the 11,140 patients who originally underwent randomization and the 8494 patients who participated in the post-trial follow-up for a median of 5.9 years (blood-pressure-lowering comparison) or 5.4 years (glucose-control comparison). Between-group differences in blood pressure and glycated hemoglobin levels during the trial were no longer evident by the first post-trial visit. The reductions in the risk of death from any cause and of death from cardiovascular causes that had been observed in the group receiving active blood-pressure-lowering treatment during the trial were attenuated but significant at the end of the post-trial follow-up; the hazard ratios were 0.91 (95% confidence interval [CI], 0.84 to 0.99; P=0.03) and 0.88 (95% CI, 0.77 to 0.99; P=0.04), respectively. No differences were observed during follow-up in the risk of death from any cause or major macrovascular events between the intensive-glucose-control group and the standard-glucose-control group; the hazard ratios were 1.00 (95% CI, 0.92 to 1.08) and 1.00 (95% CI, 0.92 to 1.08), respectively.The benefits with respect to mortality that had been observed among patients originally assigned to blood-pressure-lowering therapy were attenuated but still evident at the end of follow-up. There was no evidence that intensive glucose control during the trial led to long-term benefits with respect to mortality or macrovascular events. (Funded by the National Health and Medical Research Council of Australia and others; ADVANCE-ON ClinicalTrials.gov number, NCT00949286.).

We investigated the importance of the two catalytic α-isoforms of the 5′-AMP-activated protein kinase (AMPK) in 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside (AICAR) and contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. Incubated soleus and EDL muscle from whole-body α2- or α1-AMPK knockout (KO) and wild type (WT) mice were incubated with 2.0 mm AICAR or electrically stimulated to contraction. Both AICAR and contraction increased 2DG uptake in WT muscles. KO of α2, but not α1, abolished AICAR-induced glucose uptake, whereas neither KO affected contraction-induced glucose uptake. AICAR and contraction increased α2- and α1-AMPK activity in wild type (WT) muscles. During AICAR stimulation, the remaining AMPK activity in KO muscles increased to the same level as in WT. During contraction, the remaining AMPK activity in α2-KO muscles was elevated by 100% probably explained by a 2–3-fold increase in α1-protein. In α1-KO muscles, α2-AMPK activity increased to similar levels as in WT. Both interventions increased total AMPK activity, as expressed by AMPK-P and ACCβ-P, in WT muscles. During AICAR stimulation, this was dramatically reduced in α2-KO but not in α1-KO, whereas during contraction, both measurements were essentially similar to WT in both KO-muscles. The results show that α2-AMPK is the main donor of basal and AICAR-stimulated AMPK activity and is responsible for AICAR-induced glucose uptake. In contrast, during contraction, the two α-isoforms seem to substitute for each other in terms of activity, which may explain the normal glucose uptake despite the lack of either α2- or α1-AMPK. Alternatively, neither α-isoform of AMPK is involved in contraction-induced muscle glucose uptake. We investigated the importance of the two catalytic α-isoforms of the 5′-AMP-activated protein kinase (AMPK) in 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside (AICAR) and contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. Incubated soleus and EDL muscle from whole-body α2- or α1-AMPK knockout (KO) and wild type (WT) mice were incubated with 2.0 mm AICAR or electrically stimulated to contraction. Both AICAR and contraction increased 2DG uptake in WT muscles. KO of α2, but not α1, abolished AICAR-induced glucose uptake, whereas neither KO affected contraction-induced glucose uptake. AICAR and contraction increased α2- and α1-AMPK activity in wild type (WT) muscles. During AICAR stimulation, the remaining AMPK activity in KO muscles increased to the same level as in WT. During contraction, the remaining AMPK activity in α2-KO muscles was elevated by 100% probably explained by a 2–3-fold increase in α1-protein. In α1-KO muscles, α2-AMPK activity increased to similar levels as in WT. Both interventions increased total AMPK activity, as expressed by AMPK-P and ACCβ-P, in WT muscles. During AICAR stimulation, this was dramatically reduced in α2-KO but not in α1-KO, whereas during contraction, both measurements were essentially similar to WT in both KO-muscles. The results show that α2-AMPK is the main donor of basal and AICAR-stimulated AMPK activity and is responsible for AICAR-induced glucose uptake. In contrast, during contraction, the two α-isoforms seem to substitute for each other in terms of activity, which may explain the normal glucose uptake despite the lack of either α2- or α1-AMPK. Alternatively, neither α-isoform of AMPK is involved in contraction-induced muscle glucose uptake. The 5′-AMP-activated protein kinase (AMPK) 1The abbreviations used are: AMPK, 5′-AMP-activated protein kinase; AMPK-P, phosphorylated AMPK; ACCβ, acetyl-CoA carboxylase β; ACCβ-P, phosphorylated ACCβ; AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside; EDL, extensor digitorum longus; KO, knockout; WT, wild type; 2DG, 2-deoxy-d-glucose. is a multisubstrate serine/threonine protein kinase that is ubiquitously expressed and functions as an intracellular fuel sensor activated by depletion of high energy phosphor compounds (1.Corton J.M. Gillespie J.G. Hardie D.G. Curr. Biol. 1994; 4: 315-324Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (395) Google Scholar, 2.Hardie D.G. Carling D. Carlson M. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 821-855Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar). Activation of AMPK initiates a complex series of signaling events, causing an increase in uptake and oxidation of substrates for ATP synthesis concurrent with decreasing ATP consuming biosynthetic processes such as protein (3.Bolster D.R. Crozier S.J. Kimball S.R. Jefferson L.S. J. Biol. Chem. 2002; 277: 23977-23980Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (680) Google Scholar, 4.Horman S. Browne G. Krause U. Patel J. Vertommen D. Bertrand L. Lavoinne A. Hue L. Proud C. Rider M. Curr. Biol. 2002; 12: 1419-1423Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (377) Google Scholar), lipid (1.Corton J.M. Gillespie J.G. Hardie D.G. Curr. Biol. 1994; 4: 315-324Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (395) Google Scholar), and glycogen synthesis (5.Carling D. Hardie D.G. Biochim. Biophys. Acta. 1989; 1012: 81-86Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar, 6.Wojtaszewski J.F. Jorgensen S.B. Hellsten Y. Hardie D.G. Richter E.A. Diabetes. 2002; 51: 284-292Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar). Both human and rodent studies have shown that AMPK in skeletal muscle is activated during exercise in vivo (7.Wojtaszewski J.F. Nielsen P. Hansen B.F. Richter E.A. Kiens B. J. Physiol. 2000; 528: 221-226Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar, 8.Fujii N. Hayashi T. Hirshman M.F. Smith J.T. Habinowski S.A. Kaijser L. Mu J. Ljungqvist O. Birnbaum M.J. Witters L.A. Thorell A. Goodyear L.J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 273: 1150-1155Crossref PubMed Scopus (290) Google Scholar, 9.Winder W.W. Hardie D.G. Am. J. Physiol. 1996; 270: E299-E304Crossref PubMed Google Scholar, 10.Hutber C.A. Hardie D.G. Winder W.W. Am. J. Physiol. 1997; 272: E262-E266PubMed Google Scholar) and during contraction in vitro (11.Hayashi T. Hirshman M.F. Kurth E.J. Winder W.W. Goodyear L.J. Diabetes. 1998; 47: 1369-1373Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar, 12.Hayashi T. Hirshman M.F. Fujii N. Habinowski S.A. Witters L.A. Goodyear L.J. Diabetes. 2000; 49: 527-531Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar, 13.Ihlemann J. Ploug T. Hellsten Y. Galbo H. Am. J. Physiol. 2000; 279: E862-E867PubMed Google Scholar, 14.Ihlemann J. Ploug T. Hellsten Y. Galbo H. Am. J. Physiol. 1999; 277: E208-E214Crossref PubMed Google Scholar, 15.Derave W. Ai H. Ihlemann J. Witters L.A. Kristiansen S. Richter E.A. Ploug T. Diabetes. 2000; 49: 1281-1287Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar) probably by several coinciding mechanisms. These involve decreased ATP/AMP and PCr/Cr ratios (16.Ponticos M. Lu Q.L. Morgan J.E. Hardie D.G. Partridge T.A. Carling D. EMBO J. 1998; 17: 1688-1699Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar, 17.Hardie D.G. Salt I.P. Hawley S.A. Davies S.P. Biochem. J. 1999; 338: 717-722Crossref PubMed Scopus (317) Google Scholar), decreased pH (16.Ponticos M. Lu Q.L. Morgan J.E. Hardie D.G. Partridge T.A. Carling D. EMBO J. 1998; 17: 1688-1699Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar), and reduction of muscle glycogen content (6.Wojtaszewski J.F. Jorgensen S.B. Hellsten Y. Hardie D.G. Richter E.A. Diabetes. 2002; 51: 284-292Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar, 15.Derave W. Ai H. Ihlemann J. Witters L.A. Kristiansen S. Richter E.A. Ploug T. Diabetes. 2000; 49: 1281-1287Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar) and substrate delivery (18.Moore F. Weekes J. Hardie D.G. Eur. J. Biochem. 1991; 199: 691-697Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar, 19.Kimura N. Tokunaga C. Dalal S. Richardson C. Yoshino K. Hara K. Kemp B.E. Witters L.A. Mimura O. Yonezawa K. Genes Cells. 2003; 8: 65-79Crossref PubMed Scopus (320) Google Scholar, 20.Itani S.I. Saha A.K. Kurowski T.G. Coffin H.R. Tornheim K. Ruderman N.B. Diabetes. 2003; 52: 1635-1640Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar). Therefore, it is tempting to ascribe a role for AMPK in muscle metabolism in response to exercise, and in particular investigators have hypothesized a role for AMPK in contraction-stimulated glucose uptake (11.Hayashi T. Hirshman M.F. Kurth E.J. Winder W.W. Goodyear L.J. Diabetes. 1998; 47: 1369-1373Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar, 13.Ihlemann J. Ploug T. Hellsten Y. Galbo H. Am. J. Physiol. 2000; 279: E862-E867PubMed Google Scholar, 21.Merrill G.F. Kurth E.J. Hardie D.G. Winder W.W. Am. J. Physiol. 1997; 273: E1107-E1112Crossref PubMed Google Scholar). AMPK may also be activated by treatment with the adenosine analogue 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside (AICAR) in rat, mouse, and human skeletal muscle in vitro (6.Wojtaszewski J.F. Jorgensen S.B. Hellsten Y. Hardie D.G. Richter E.A. Diabetes. 2002; 51: 284-292Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar, 11.Hayashi T. Hirshman M.F. Kurth E.J. Winder W.W. Goodyear L.J. Diabetes. 1998; 47: 1369-1373Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar, 21.Merrill G.F. Kurth E.J. Hardie D.G. Winder W.W. Am. J. Physiol. 1997; 273: E1107-E1112Crossref PubMed Google Scholar, 22.Al Khalili L. Chibalin A.V. Kannisto K. Zhang B.B. Permert J. Holman G.D. Ehrenborg E. Ding V.D. Zierath J.R. Krook A. Cell Mol. Life Sci. 2003; 60: 991-998Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar) and in vivo in conscious rats (23.Bergeron R. Russell III, R.R. Young L.H. Ren J.M. Marcucci M. Lee A. Shulman G.I. Am. J. Physiol. 1999; 276: E938-E944Crossref PubMed Google Scholar). AICAR is taken up by the cell and is phosphorylated to ZMP, which mimics the activating effect of AMP on AMPK (2.Hardie D.G. Carling D. Carlson M. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 821-855Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar, 24.Corton J.M. Gillespie J.G. Hawley S.A. Hardie D.G. Eur. J. Biochem. 1995; 229: 558-565Crossref PubMed Scopus (1029) Google Scholar) without affecting the adenosine nucleotide or phosphocreatine status of the cell (12.Hayashi T. Hirshman M.F. Fujii N. Habinowski S.A. Witters L.A. Goodyear L.J. Diabetes. 2000; 49: 527-531Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar, 21.Merrill G.F. Kurth E.J. Hardie D.G. Winder W.W. Am. J. Physiol. 1997; 273: E1107-E1112Crossref PubMed Google Scholar). Furthermore, AMPK can be activated by the antidiabetic drugs metformin (25.Hawley S.A. Gadalla A.E. Olsen G.S. Hardie D.G. Diabetes. 2002; 51: 2420-2425Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar, 26.Musi N. Hirshman M.F. Nygren J. Svanfeldt M. Bavenholm P. Rooyackers O. Zhou G. Williamson J.M. Ljunqvist O. Efendic S. Moller D.E. Thorell A. Goodyear L.J. Diabetes. 2002; 51: 2074-2081Crossref PubMed Scopus (665) Google Scholar, 27.Fryer L.G. Parbu-Patel A. Carling D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25226-25232Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (912) Google Scholar) and rosiglitazone (27.Fryer L.G. Parbu-Patel A. Carling D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25226-25232Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (912) Google Scholar). Treatment with AICAR increases glucose uptake by an insulin-independent mechanism (11.Hayashi T. Hirshman M.F. Kurth E.J. Winder W.W. Goodyear L.J. Diabetes. 1998; 47: 1369-1373Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar) that seems to depend on translocation of GLUT4 to the muscle surface membrane (28.Kurth-Kraczek E.J. Hirshman M.F. Goodyear L.J. Winder W.W. Diabetes. 1999; 48: 1667-1671Crossref PubMed Scopus (587) Google Scholar). Activation of AMPK by exercise or drugs seems to have important therapeutic possibilities in the fight against conditions characterized by decreased insulin sensitivity such as type 2 diabetes and the metabolic syndrome. This view is supported by findings showing that short term activation of AMPK by AICAR increases insulin sensitivity of skeletal muscle (29.Fisher J.S. Gao J. Han D.H. Holloszy J.O. Nolte L.A. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2002; 282: E18-E23Crossref PubMed Google Scholar). Long term treatment with AICAR has also been shown to improve the metabolic status of obese KKAy-CETP mice (30.Fiedler M. Zierath J.R. Selen G. Wallberg-Henriksson H. Liang Y. Sakariassen K.S. Diabetologia. 2001; 44: 2180-2186Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar) and diabetic ob/ob and db/db mice (31.Halseth A.E. Ensor N.J. White T.A. Ross S.A. Gulve E.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294: 798-805Crossref PubMed Scopus (58) Google Scholar, 32.Song X.M. Fiedler M. Galuska D. Ryder J.W. Fernstrom M. Chibalin A.V. Wallberg-Henriksson H. Zierath J.R. Diabetologia. 2002; 45: 56-65Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar) as well as obese Zucker rats (33.Buhl E.S. Jessen N. Pold R. Ledet T. Flyvbjerg A. Pedersen S.B. Pedersen O. Schmitz O. Lund S. Diabetes. 2002; 51: 2199-2206Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar), possibly by increasing the level of GLUT4 protein and various oxidative enzymes in skeletal muscle (34.Winder W.W. Holmes B.F. Rubink D.S. Jensen E.B. Chen M. Holloszy J.O. J. Appl. Physiol. 2000; 88: 2219-2226Crossref PubMed Scopus (602) Google Scholar, 35.Holmes B.F. Kurth-Kraczek E.J. Winder W.W. J. Appl. Physiol. 1999; 87: 1990-1995Crossref PubMed Scopus (423) Google Scholar). In vitro studies of isolated mouse skeletal muscles overexpressing a kinase dead AMPK construct showed that AICAR- and hypoxia-stimulated glucose uptake was totally abolished, whereas contraction-stimulated glucose uptake was lowered by 30–40% (36.Mu J. Brozinick Jr., J.T. Valladares O. Bucan M. Birnbaum M.J. Mol. Cell. 2001; 7: 1085-1094Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (800) Google Scholar). This clearly indicates dissimilarities between AICAR/hypoxia- and contraction-stimulated glucose transport in that AMPK is only partially responsible for contraction to stimulate muscle glucose transport. AMPK is a heterotrimeric enzyme complex consisting of a catalytic α-subunit and regulatory β- and γ-subunits. Two isoforms have been identified of the α-subunit (α1 and α2) and β-subunit (β1 and β2) and three isoforms of the γ-subunit (γ1, γ2, and γ3) (37.Stapleton D. Mitchelhill K.I. Gao G. Widmer J. Michell B.J. Teh T. House C.M. Fernandez C.S. Cox T. Witters L.A. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 611-614Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar, 38.Stapleton D. Woollatt E. Mitchelhill K.I. Nicholl J.K. Fernandez C.S. Michell B.J. Witters L.A. Power D.A. Sutherland G.R. Kemp B.E. FEBS Lett. 1997; 409: 452-456Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 39.Cheung P.C. Salt I.P. Davies S.P. Hardie D.G. Carling D. Biochem. J. 2000; 346: 659-669Crossref PubMed Scopus (533) Google Scholar). To date, it is not known which of the two catalytic α-isoforms convey the effects on glucose transport in skeletal muscle. It is also not known which of the two isoforms constitute the dominant isoform in skeletal muscle. These questions are important from a physiological point of view but also because design of drugs targeting AMPK may be facilitated if the precise α-AMPK isoform responsible for the desired metabolic effects is known. To investigate this further, AMPK was activated by AICAR or contraction in muscles consisting of predominantly slow or fast twitch fiber types from mice that do not express either the α2- or α1-AMPK isoform. Here we show that AICAR stimulation of muscle glucose uptake requires the presence of the α2-isoform, whereas, in this respect, the α1-isoform is of no relevance. In contrast, neither of the two knockouts markedly decreases contraction-stimulated glucose uptake. A mouse 129-strain genomic library (Stratagene, La Jolla, CA) was screened with a specific mouse AMPK catalytic α1-subunit 500-bp fragment made by reverse transcription-polymerase chain reaction on liver messenger RNA using the forward 5′-AGGGCCCGACACACCCTAGA-3′ and the reverse 5′-TGTGACTTCCTGGTCTTGGA-3′ primers. One genomic clone encompassing a 14.5-kb genomic fragment was used to generate the targeting construct. This fragment contains the exons encoding the N terminus catalytic domain of the α1-AMPK subunit corresponding to amino acids 31–239. A 4-kb HincII-BpmI 5′ homologous genomic fragment was blunted, modified by the addition of NotI linkers, and subcloned into the 5′ NotI site of the previously reported IRES-βgeo (40.Vallet V.S. Casado M. Henrion A.A. Bucchini D. Raymondjean M. Kahn A. Vaulont S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20175-20179Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (116) Google Scholar). This plasmid was SalI-digested, and the 3′ α1 homologous fragment, consisting of a 3-kb SacI-SacI fragment, was inserted. The resulting targeting construct was linearized at the unique XhoI site and 40 μg was used to electroporate 1 × 107 embryonic stem cells (ES cells; a kind gift from Anne K. Voss, Gottingen, Germany), which were cultured on mitomycin-treated embryonic fibroblast feeder layers. DNA from clones surviving G418 selection (200 μg/ml) was individually analyzed on Southern blot. DNA was EcoRI-digested and hybridized either with a 5′ external probe consisting of a genomic SalI-HincII fragment or with a 3′ external probe consisting of a SacI-SacI genomic fragment (Fig. 1A). Positive ES cells were injected into blastocysts derived from C57BL/6J mice, and chimeric males were mated to wild type C57BL/6J females for the germ line transmission as previously described (41.Vallet V.S. Henrion A.A. Bucchini D. Casado M. Raymondjean M. Kahn A. Vaulont S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 21944-21949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar). Mice heterozygous for the gene targeting event were then used to generate the homozygous α1-AMPK mutant mice. α2-AMPK genomic clones were isolated after screening a mouse 129 strain genomic library (Stratagene, La Jolla, CA). The targeting construct was generated by flanking exon C, which encodes the α2-AMPK catalytic domain with loxP sites for the Cre recombinase and inserting a phosphoglycerol kinase promoter-driven neomycin selection cassette flanked by an additional loxP site. The generation of the α2-AMPK knockout mouse and its phenotype has recently been described elsewhere; for details, see Viollet et al. (42.Viollet B. Andreelli F. Jorgensen S.B. Perrin C. Geloen A. Flamez D. Mu J. Lenzner C. Baud O. Bennoun M. Gomas E. Nicolas G. Wojtaszewski J.F. Kahn A. Carling D. Schuit F.C. Birnbaum M.J. Richter E.A. Burcelin R. Vaulont S. J. Clin. Invest. 2003; 111: 91-98Crossref PubMed Scopus (442) Google Scholar). All experiments were approved by the Danish Animal Experimental Inspectorate and complied with the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experiments and Other Scientific Purposes (Council of Europe 123, Strasbourg, France, 1985). Four-month-old male and female α1-AMPK knockout (KO) and wild type (WT) mice as well as male α2-AMPK KO and WT mice were studied. Within each strain, KO and WT mice used for experiments were littermates produced by intercross-breeding using heterozygote parent animals. The genotype of the offspring was first determined by PCR on DNA extracted from a tail biopsy tested against positive control samples. The lack of α-AMPK protein was later verified by immunoblotting on samples from muscle tissue. The mice were maintained on a 12 h/12 h light-dark cycle and received standard rodent chow (Altromin 1324, Chr. Pedersen A/S, Ringsted, Denmark) and water ad libitum. Tolerance tests were performed on both α2- and α1-AMPK KO and corresponding WT mice. Glucose (2 g/kg), insulin (0.5 units/kg; Actrapid, Novo Nordisk, Bagsværd, Denmark), or AICAR (250 mg/kg; Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, CA) was given intraperitoneally at time 0 (isotonic solutions). Tail blood was collected at –20, 20, 40, 60, 105, and 150 min, and blood glucose concentration was determined using a glucometer (Bayer, Leverkusen, Germany). Mice were semifasted before the glucose and AICAR tolerance test (received 40% of daily food intake 18 h prior to test) but were fed before the insulin tolerance tests. Area under the curve (AUC; mm·min) is calculated from the changes in blood glucose concentration at time point 20–150 min compared with basal value at time –20 min. Soleus (mainly slow twitch fibers) and extensor digitorum longus (EDL; mainly fast twitch fibers) were obtained from anesthetized mice (6 mg of pentobarbital 100 g–1 body weight) and suspended by ligatures at resting tension (4–5 millinewtons) in incubation chambers (Multi Myograph system; Danish Myo-Technology, Aarhus, DK) in a Krebs-Henseleit buffer at 30 °C (42.Viollet B. Andreelli F. Jorgensen S.B. Perrin C. Geloen A. Flamez D. Mu J. Lenzner C. Baud O. Bennoun M. Gomas E. Nicolas G. Wojtaszewski J.F. Kahn A. Carling D. Schuit F.C. Birnbaum M.J. Richter E.A. Burcelin R. Vaulont S. J. Clin. Invest. 2003; 111: 91-98Crossref PubMed Scopus (442) Google Scholar). AICAR Stimulation—AICAR (2 mm, 40 min, Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Canada) was added after 10 min of basal incubation. Contraction—After 40 min of basal incubation, contraction was induced by electrical stimulation with a 10-s train (100-Hz, 0.2-ms impulse, ∼30 V) per min for 10 min. After incubation, muscles were harvested, washed in ice-cold Krebs-Henseleit buffer, blotted on filter paper, and quickly frozen with aluminum tongs precooled in liquid nitrogen and stored at –80 °C. In some experiments, 2-deoxy-d-glucose (2DG) uptake was measured by adding 2-[2,6-3H]deoxy-d-glucose (1 mm) and [1-14C]mannitol (8 mm) (Amersham Biosciences) to the medium (specific activities of the two tracers in the medium were 0.128 and 0.083 μCi ml–1, respectively). During AICAR incubation, 2DG uptake was measured during the last 10 min of incubation. During muscle contraction, 2DG uptake was measured during the last 5 min of muscle contraction and the first 5 min into recovery (42.Viollet B. Andreelli F. Jorgensen S.B. Perrin C. Geloen A. Flamez D. Mu J. Lenzner C. Baud O. Bennoun M. Gomas E. Nicolas G. Wojtaszewski J.F. Kahn A. Carling D. Schuit F.C. Birnbaum M.J. Richter E.A. Burcelin R. Vaulont S. J. Clin. Invest. 2003; 111: 91-98Crossref PubMed Scopus (442) Google Scholar). Radioactivity in the supernatant was measured using liquid scintillation counting (Tri-Carb 2000; Packard Instrument Co.). Muscles were homogenized in ice-cold buffer (20 mm Tris base, 50 mm NaCl, 2 mm dithiothreitol, 50 mm NaF, 1% Triton X-100, 250 mm sucrose, 5 mm sodium pyrophosphate, 4 μg/ml leupeptin, 6 mm benzamidine, 500 μm phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg/ml soybean trypsin inhibitor, pH 7.4) for 20 s using a homogenizer (PT 3100; Brinkmann Instruments). Homogenates were rotated end over end for 1 h at 4 °C. Lysates were generated by centrifugation (17,500 × g) for 1 h at 4 °C. Lysates were quick frozen in liquid nitrogen and stored at –80 °C. Protein content in lysates was measured by the bicinchoninic acid method (Pierce). Protein levels of the α1- and α2-AMPK subunits were determined by SDS-PAGE followed by immunoblotting using polyclonal antibodies generated in sheep as described by Woods et al. (43.Woods A. Salt I. Scott J. Hardie D.G. Carling D. FEBS Lett. 1996; 397: 347-351Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar) (antibodies were kindly donated by D. G. Hardie, University of Dundee, UK). ACCβ protein was accessed using horseradish peroxidase-conjugated streptavidin (DakoCytomatione, Glostrup, Denmark) as described by Wojtaszewski et al. (44.Wojtaszewski J.F. Mourtzakis M. Hillig T. Saltin B. Pilegaard H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 298: 309-316Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). GLUT4 protein was assessed in total crude membrane using polyclonal antibody raised against a peptide corresponding to the mouse GLUT4 C terminus sequence (Chemicon International Inc.) as described by Ploug et al. (45.Ploug T. Wojtaszewski J. Kristiansen S. Hespel P. Galbo H. Richter E.A. Am. J. Physiol. 1993; 264: E270-E278PubMed Google Scholar). α-AMPK Thr172 phosphorylation was measured by immunoblotting using a phosphospecific antibody (Cell Signaling Technologies). ACCβ Ser227 phosphorylation was determined by immunoblotting using a phosphospecific antibody (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY). This antibody is raised against a peptide corresponding to the sequence in rat liver ACCα around the Ser79 phosphorylation site, but the antibody also recognizes the mouse ACCβ when phosphorylated most likely on the corresponding Ser227. Muscle lysate protein was loaded on 7.5% Tris-HCl Criterion gels (Bio-Rad) and transferred to polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon Transfer Membrane, Millipore A/S, Glostrup, DK) by semi-wet blotting. Membranes were blocked in TBST containing 1 or 2% low fat milk protein for 1 h at room temperature. Membranes were then incubated with primary antibodies overnight at 4 °C, followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody for 2 h at room temperature (rabbit anti-sheep immunoglobulins, horse-radish peroxidase-conjugated; DAKO, Glostrup, Denmark). Bands were visualized using an Eastman Kodak Co. Image Station 440CF and enhanced chemoluminescence (ECL+). Bands were quantified using Kodak 1D 3.5 software, and protein content was expressed in relative units in comparison with control samples loaded on each gel. α-Isoform-specific AMPK activity was measured in vitro in immunoprecipitates from 100 μg of muscle lysate protein using anti-α1 and anti-α2 antibodies. The protocol was identical to the one previously described (7.Wojtaszewski J.F. Nielsen P. Hansen B.F. Richter E.A. Kiens B. J. Physiol. 2000; 528: 221-226Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar) except for the kinase reaction time (45 min). Muscle glycogen content was determined as glycosyl units after acid hydrolysis (46.Lowry O.H. Passonneau J.V. A Flexible System of Enzymatic Analysis. Academic Press, London1972: 1-291Google Scholar). Mice were starved for 5 h (from 5:00 to 10:00 p.m.), samples were obtained from tail blood, and serum insulin was assessed using a rat enzyme-linked immunosorbent assay kit with a mouse insulin standard (Crystal Chem Inc., Chicago, IL). Contraction force was measured by a force transducer connected to one end of the muscle by the ligature. Force generated was registered on a computer and was expressed as the average force generated (above resting tension) during the 10 stimulation periods. The degree of “fatigue” was obtained by comparing the mean contraction force during stimulation trains 8–10 with the first stimulation train and is expressed as the percentage decrease in mean contraction force. Control samples were added to both kinase activity assays and immunoblots, and assay-to-assay variation was accounted for by expressing the data relative to these samples. Data are expressed as means ± S.E. Statistical evaluation was performed by two-way analysis of variance for repeated measurements or Student's two-tailed t test. When analysis of variance revealed significant differences, the Student-Newman-Keuls method was used as a post hoc test to correct for multiple comparisons. Differences between groups were considered statistically significant if p was <0.05. Generation of α-AMPK Knockout Mice—The description of the α2-AMPK KO mice is published elsewhere; for details, see Viollet et al. (42.Viollet B. Andreelli F. Jorgensen S.B. Perrin C. Geloen A. Flamez D. Mu J. Lenzner C. Baud O. Bennoun M. Gomas E. Nicolas G. Wojtaszewski J.F. Kahn A. Carling D. Schuit F.C. Birnbaum M.J. Richter E.A. Burcelin R. Vaulont S. J. Clin. Invest. 2003; 111: 91-98Crossref PubMed Scopus (442) Google Scholar). In order to inactivate the AMPK catalytic α1-subunit gene, a replacement vector was constructed with 7 kb of ES-129-derived genomic fragment and a selection cassette deleting part of the catalytic domain of α1-AMPK from amino acids 97–157 (Fig. 1A). As shown in Fig. 1B, hybridization of EcoRI-digested genomic DNAs with the indicated 5′ external probe led to WT alleles of 5.5 kb and mutated alleles of 5.0 kb. Immunoblot analysis (Fig. 1C) of protein extracts prepared from α1-AMPK knockout liver and skeletal muscle showed undetectable α1-protein and a level of α2-protein comparable with that observed in extracts from WT mice. α1-, α2-, ACCβ-, and GLUT4-protein Levels—Gene targeting for either the α2- or α1-subunit resulted in complete lack of expression of these subunits at the protein level (Table I and Fig. 2). In the α2 knockout muscles, a compensatory 200–300% increase in the protein level of the remaining α1-isoform was observed in EDL and soleus. In the α1-KO soleus muscles, a ∼60% increase in the remaining α2-isoform was observed, whereas no change was seen in EDL. The protein level of ACCβ was also measured in the two muscles and was expressed to the same level in both of the two knockout strains (Table I and Fig. 2). The GLUT4 protein content was measured in the gastrocnemius muscle and was expressed to the same level in both of the two knockout strains (Table II and Fig. 2).Table Iα1-, α2- and ACCβ-protein levels in EDL and soleus muscles from α1- or α2-AMPK knockout miceMuscleGenotypeProtein contentα2α1ACCβEDLα2-WT1.4 ± 0.20.9 ± 0.10.6 ± 0.1α2-KOND1.9 ± 0.3*0.6 ± 0.1Soleusα2-WT0.7 ± 0.11.2 ± 0.21.4 ± 0.2α2-KOND3.3 ± 0.5*1.2 ± 0.2EDLα1-WT2.3 ± 0.21.1 ± 0.21.1 ± 0.1α1-KO2.3 ± 0.3ND1.0 ± 0.1Soleusα1-WT0.7 ± 0.11.2 ± 0.11.5 ± 0.1α1-KO1.1 ± 0.1*ND1.5 ± 0.1 Open table in a new tab Table IIGLUT4 protein level in gastrocnemius muscle from α1- or α2-AMPK knockout miceMuscleProtein contentGenotypeGLUT4Gast.α2-WT1.8 ± 0.2α2-KO2.1 ± 0.3Gast.α1-WT1.8 ± 0.4α1-KO1.9 ± 0.2 Open table in a new tab Phenotype of Knockout Mice—A detailed description of the α2-AMPK KO mouse phenotype has been published recently (42.Viollet B. Andreelli F. Jorgensen S.B. Perrin C. Geloen A. Flamez D. Mu J. Lenzner C. Baud O. Bennoun M. Gomas E. Nicolas G. Wojtaszewski J.F. Kahn A. Carling D. Schuit

1 Age-associated loss of skeletal muscle mass and strength can partly be counteracted by resistance training, causing a net synthesis of muscular proteins. Protein synthesis is influenced synergistically by postexercise amino acid supplementation, but the importance of the timing of protein intake remains unresolved. 2 The study investigated the importance of immediate (P0) or delayed (P2) intake of an oral protein supplement upon muscle hypertrophy and strength over a period of resistance training in elderly males. 3 Thirteen men (age, 74 ± 1 years; body mass index (BMI), 25 ± 1 kg m−2 (means ± S.E.M.)) completed a 12 week resistance training programme (3 times per week) receiving oral protein in liquid form (10 g protein, 7 g carbohydrate, 3 g fat) immediately after (P0) or 2 h after (P2) each training session. Muscle hypertrophy was evaluated by magnetic resonance imaging (MRI) and from muscle biopsies and muscle strength was determined using dynamic and isokinetic strength measurements. Body composition was determined from dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) and food records were obtained over 4 days. The plasma insulin response to protein supplementation was also determined. 4 In response to training, the cross-sectional area of m. quadriceps femoris (54.6 ± 0.5 to 58.3 ± 0.5 cm2) and mean fibre area (4047 ± 320 to 5019 ± 615 μm2) increased in the P0 group, whereas no significant increase was observed in P2. For P0 both dynamic and isokinetic strength increased, by 46 and 15 %, respectively (P < 0.05), whereas P2 only improved in dynamic strength, by 36 % (P < 0.05). No differences in glucose or insulin response were observed between protein intake at 0 and 2 h postexercise. 5 We conclude that early intake of an oral protein supplement after resistance training is important for the development of hypertrophy in skeletal muscle of elderly men in response to resistance training.

Muscle glycogen stores are depleted during exercise and are rapidly repleted during the recovery period. To investigate the mechanism for this phenomenon, untrained male rats were run for 45 min on a motor-driven treadmill and the ability of their muscles to utilize glucose was then assessed during perfusion of their isolated hindquarters. Glucose utilization by the hindquarter was the same in exercised and control rats perfused in the absence of added insulin; however, when insulin (30-40,000 muU/ml) was added to the perfusate, glucose utilization was greater after exercise. Prior exercise lowered both, the concentration of insulin that half-maximally stimulated glucose utilization (exercise, 150 muU/ml; control, 480 muU/ml) and modestly increased its maximum effect. The increase in insulin sensitivity persisted for 4 h following exercise, but was not present after 24 h. The rate-limiting step in glucose utilization enhanced by prior exercise appeared to be glucose transport across the cell membrane, as in neither control nor exercised rats did free glucose accumulate in the muscle cell. Following exercise, the ability of insulin to stimulate the release of lactate into the perfusate was unaltered; however its ability to stimulate the incorporation of [(14)C]glucose into glycogen in certain muscles was enhanced. Thus at a concentration of 75 muU/ml insulin stimulated glycogen synthesis eightfold more in the fast-twitch red fibers of the red gastrocnemius than it did in the same muscle of nonexercised rats. In contrast, insulin only minimally increased glycogen synthesis in the fast-twitch white fibers of the gastrocnemius, which were not glycogen-depleted. The uptake of 2-deoxyglucose by these muscles followed a similar pattern suggesting that glucose transport was also differentially enhanced. Prior exercise did not enhance the ability of insulin to convert glycogen synthase from its glucose-6-phosphate-dependent (D) to its glucose-6-phosphate-independent (1) form. On the other hand, following exercise, insulin prevented a marked decrease in muscle glucose-6-phosphate, which could have diminished synthase activity in situ. The possibility that exercise enhanced the ability of insulin to convert glycogen synthase D to an intermediate form of the enzyme, more sensitive to glucose-6-phosphate, remains to be explored. These results suggest that following exercise, glucose transport and glycogen synthesis in skeletal muscle are enhanced due at least in part to an increase in insulin sensitivity. They also suggest that this increase in insulin sensitivity occurs predominantly in muscle fibers that are deglycogenated during exercise.

AMP-activated protein kinase (AMPK) is viewed as a fuel sensor for glucose and lipid metabolism. To better understand the physiological role of AMPK, we generated a knockout mouse model in which the AMPKalpha2 catalytic subunit gene was inactivated. AMPKalpha2(-/-) mice presented high glucose levels in the fed period and during an oral glucose challenge associated with low insulin plasma levels. However, in isolated AMPKalpha2(-/-) pancreatic islets, glucose- and L-arginine-stimulated insulin secretion were not affected. AMPKalpha2(-/-) mice have reduced insulin-stimulated whole-body glucose utilization and muscle glycogen synthesis rates assessed in vivo by the hyperinsulinemic euglycemic clamp technique. Surprisingly, both parameters were not altered in mice expressing a dominant-negative mutant of AMPK in skeletal muscle. Furthermore, glucose transport was normal in incubated isolated AMPKalpha2(-/-) muscles. These data indicate that AMPKalpha2 in tissues other than skeletal muscles regulates insulin action. Concordantly, we found an increased daily urinary catecholamine excretion in AMPKalpha2(-/-) mice, suggesting altered function of the autonomic nervous system that could explain both the impaired insulin secretion and insulin sensitivity observed in vivo. Therefore, extramuscular AMPKalpha2 catalytic subunit is important for whole-body insulin action in vivo, probably through modulation of sympathetic nervous activity.

Exercise stimulates the release of molecules into the circulation, supporting the concept that inter-tissue signaling proteins are important mediators of adaptations to exercise. Recognizing that many circulating proteins are packaged in extracellular vesicles (EVs), we employed quantitative proteomic techniques to characterize the exercise-induced secretion of EV-contained proteins. Following a 1-hr bout of cycling exercise in healthy humans, we observed an increase in the circulation of over 300 proteins, with a notable enrichment of several classes of proteins that compose exosomes and small vesicles. Pulse-chase and intravital imaging experiments suggested EVs liberated by exercise have a propensity to localize in the liver and can transfer their protein cargo. Moreover, by employing arteriovenous balance studies across the contracting human limb, we identified several novel candidate myokines, released into circulation independently of classical secretion. These data identify a new paradigm by which tissue crosstalk during exercise can exert systemic biological effects.

1 5′-AMP-activated protein kinase (AMPK) has been suggested to play a key role in the regulation of metabolism in skeletal muscle. AMPK is activated in treadmill-exercised and electrically stimulated rodent muscles. Whether AMPK is activated during exercise in humans is unknown. 2 We investigated the degree of activation and deactivation of α-isoforms of AMPK during and after exercise. Healthy human subjects performed bicycle exercise on two separate occasions at either a low (∼50% maximum rate of O2 uptake (V̇O2,max) for 90 min) or a high (∼75% V̇O2,max for 60 min) intensity. Biopsies from the vastus lateralis muscle were obtained before and immediately after exercise, and after 3 h of recovery. 3 We observed a 3- to 4-fold activation of the α2-AMPK isoform immediately after high intensity exercise, whereas no activation was observed after low intensity exercise. The activation of α2-AMPK was totally reversed 3 h after exercise. In contrast, α1-AMPK was not activated during either of the two exercise trials. 4 The in vitro AMP dependency of α2-AMPK was significantly greater than that of α1-AMPK (∼3- vs.∼2-fold). 5 We conclude that in humans activation of α2-AMPK during exercise is dependent upon exercise intensity. The stable activation of α2-AMPK, presumably due to the activation of an upstream AMPK kinase, is compatible with a role for this kinase complex in the regulation of skeletal muscle metabolism during exercise, whereas the lack of stable α1-AMPK activation makes this kinase complex a less likely candidate.