Accumulation of fumarate resulting from mutations in fumarate hydratase,which are associated with renal and other cancers, is shown to induce epithelial-to-mesenchymal transition—a process associated with cancer initiation. Mutations of the tricarboxylic acid cycle enzyme fumarate hydratase cause hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer1. Fumarate hydratase-deficient renal cancers are highly aggressive and metastasize even when small, leading to a very poor clinical outcome2. Fumarate, a small molecule metabolite that accumulates in fumarate hydratase-deficient cells, plays a key role in cell transformation, making it a bona fide oncometabolite3. Fumarate has been shown to inhibit α-ketoglutarate-dependent dioxygenases that are involved in DNA and histone demethylation4,5. However, the link between fumarate accumulation, epigenetic changes, and tumorigenesis is unclear. Here we show that loss of fumarate hydratase and the subsequent accumulation of fumarate in mouse and human cells elicits an epithelial-to-mesenchymal-transition (EMT), a phenotypic switch associated with cancer initiation, invasion, and metastasis6. We demonstrate that fumarate inhibits Tet-mediated demethylation of a regulatory region of the antimetastatic miRNA cluster6 mir-200ba429, leading to the expression of EMT-related transcription factors and enhanced migratory properties. These epigenetic and phenotypic changes are recapitulated by the incubation of fumarate hydratase-proficient cells with cell-permeable fumarate. Loss of fumarate hydratase is associated with suppression of miR-200 and the EMT signature in renal cancer and is associated with poor clinical outcome. These results imply that loss of fumarate hydratase and fumarate accumulation contribute to the aggressive features of fumarate hydratase-deficient tumours.

Overexpression of the human epidermal growth factor 2 (HER2) protein in breast cancer patients is a predictor of poor prognosis and resistance to therapies. Despite significant advances in the development of targeted therapies and improvements in the 5-year survival rate of metastatic HER2-positive breast cancer patients, a better understanding of the disease at an early stage is needed to prevent its progression. Here, we used an inducible breast cancer transformation system that allows investigation of early molecular changes at high temporal resolution. HER2 overexpression to similar levels as those observed in a subtype of HER2 positive breast cancer patients induced transformation of MCF10A cells and resulted in gross morphological changes, increased anchorage-independent growth of cells, and altered transcriptional programme of genes associated with oncogenic transformation. Global phosphoproteomic analysis during the first few hours of HER2 induction predominantly detected an increase in protein phosphorylation. Intriguingly, this correlated with a wave of chromatin opening, as measured by ATAC-seq on acini isolated from 3D cell culture. We observed that HER2 overexpression leads to reprogramming of many distal regulatory regions and promotes reprogramming-associated heterogeneity. We found that a subset of cells acquired a dedifferentiated breast stem-like phenotype, making them likely candidates for malignant transformation. Our data show that this population of cells, which counterintuitively enriches for relatively low HER2 protein abundance and increased chromatin accessibility, possesses transformational drive, resulting in increased anchorage-independent growth in vitro compared to cells not displaying a stem-like phenotype. Our data provide a discovery platform for signalling to chromatin pathways in HER2-driven cancers, offering an opportunity for biomarker discovery and identification of novel drug targets.

Abstract Identification of specific and therapeutically actionable vulnerabilities in acute myeloid leukaemia (AML) is needed to improve patients’ outcome. These features should be ideally present in many patients independently of mutational background. Here we identify de novo fatty acid (FA) desaturation, specifically stearoyl-CoA desaturase (SCD) inhibition, as a therapeutic vulnerability across multiple AML models in vitro and in vivo . We use the novel clinical grade SCD inhibitor SSI-4 to show that SCD inhibition induces AML cell death via pleiotropic effects, and sensitivity is based on their dependency on FA desaturation regardless of mutational profile. SSI-4 efficacy is enhanced by driving FA biosynthesis in vitro while stroma confers protective effects that extend to in vivo models. SCD inhibition increases DNA damage and its combination with standard DNA damage-inducing chemotherapy prolongs survival in aggressive murine AML models. Our work supports developing FA desaturase inhibitors in AML while stressing the importance of identifying predictive biomarkers of response and biologically validated combination therapies to realize their therapeutic potential. One Sentence Summary SCD inhibition is toxic to AML cells with high rates of fatty acid desaturation and in combination with chemotherapy prolongs survival in murine AML models.

6525 Background: AML is a heterogeneous hematological malignancy with poor prognosis. Several treatments are approved for AML, but clinical trials have shown that current stratification approaches to determine patients’ eligibility produce false positives (treated patients that fail to respond) and negatives (patients not treated but could have responded). Venetoclax + azacitidine (VA) treatment is currently reserved for unfit patients, with younger patients stratified based on their FLT3status, and treated with either intensive chemotherapy (IC), or IC plus midostaurin (MIC). Here, we used phosphoproteomics to build a signature and algorithm that accurately predict which of these approved therapies may be more efficacious for a given patient. Methods: Routine bone marrow and peripheral blood diagnosis samples (s, n=182) were collected across the UK, Austria, Canada and the USA from 138 patients (p) subsequently treated with MIC (n=44/64 p/s), VA (n=40/48 p/s) or IC (n=54/70 p/s). Patients were grouped into Good Responders (GR) and Poor Responders (PR) based on treatment response. For VA, patients that achieved complete remission (CR) were considered GR, while refractory patients were considered PR. For MIC and IC, we considered patients that achieved CR without relapse within 6 months as GR, and those refractory or relapsed within 6 months as PR. Samples were processed for mass spectrometry-based phosphoproteomics. Phosphopeptide abundance data, generated with in-house PiQuant software, was used to identify phosphopeptides that distinguish GR and PR groups in each cohort. Statistical models based on these features were assessed via cross-validation. Results: We compared phosphoproteomes of 182 diagnosis samples from 138 AML patients, from three treatment cohorts (treated with IC, MIC or VA), with each cohort stratified by patients’ response to their respective treatment. Enrichment analysis in each cohort identified several phosphopeptides specific to one of the responder groups, mapping both to proteins with known roles in AML biology (e.g. DNMT3A or RUNX1) and proteins not yet implicated. Next, using machine learning, we identified phosphopeptides that could distinguish between PR and GR, and trained drug response prediction models based on the abundance of these phosphopeptides. In cross-validation, each model stratified patients with log rank p<0.001, HR<0.1 and more than 90% accuracy, greatly outperforming all currently-used stratification methods for first-line AML therapies. Conclusions: We built a suite of predictive models that accurately predict patient response to first-line AML treatment using phosphoproteomic data from routine diagnosis samples. Following validation in independent patient cohorts, this tool will be developed into a single test that predicts treatment response for AML patients, thus addressing an unmet clinical need in this disease.

Kinases are intracellular signalling mediators and key to sustaining the inflammatory process in rheumatoid arthritis (RA). Oral inhibitors of Janus Kinase family (JAKs) are widely used in RA, while inhibitors of other kinase families e.g. phosphoinositide 3-kinase (PI3K) are under development. Most current biomarker platforms quantify mRNA/protein levels, but give no direct information on whether proteins are active/inactive. Phosphoproteome analysis has the potential to measure specific enzyme activation status at tissue level.

The IκB kinase ε (IKKε) is a key molecule at the crossroads of inflammation and cancer. Known for its role as an activator of NFκB and IRF3 signalling leading to cytokine secretion, the kinase is also a breast cancer oncogene, overexpressed in a variety of tumours. However, to what extent IKKε remodels cellular metabolism is currently unknown. Here we used a combination of metabolomics and phosphoproteomics to show that IKKε orchestrates a complex metabolic reprogramming that affects mitochondrial metabolism and serine biosynthesis. Acting independently of its canonical signalling role, IKKε upregulates the serine biosynthesis pathway (SBP) mainly by limiting glucose and pyruvate derived anaplerosis of the TCA cycle. In turn, this elicits activation of the transcription factor ATF4 and upregulation of the SBP genes. Importantly, pharmacological inhibition of the IKKε-induced metabolic phenotype reduces proliferation of breast cancer cells. Finally, we show that in a set of basal ER negative and highly proliferative human breast cancer tumours, IKKε and PSAT1 expression levels are positively correlated corroborating the link between IKKε and the SBP in the clinical context.

Chromatin remodelling complexes (CRCs) participate in oligodendrocyte (OL) differentiation, survival and maintenance. We asked whether CRCs also control proliferation of OL precursors (OPs) - focusing on the INO80 complex, which is known to regulate proliferation of a variety of other cell types during development and disease. CRISPR/Cas9-mediated inactivation of Ino80 in vitro, or Cre-mediated deletion in vivo, slowed the OP cell cycle substantially by prolonging G1, without inducing OL differentiation. RNAseq analysis revealed that E2F target genes were dysregulated in OPs from INO80-deficient mice, but correlated RNAseq and ATAC-seq uncovered no general correlation beween gene expression and altered nucleosome positioning at transcription start sites. Fluorescence photobleaching experiments in cultured OPs demonstrated that histone H2A.Z mobility increased following loss of INO80, suggesting that INO80 regulates the cell cycle machinery in OPs through H2A.Z/ H2A exchange. We also present evidence that INO80 associates with OLIG2, a master regulator of OL development.

Abstract Motivation Anti-cancer drug response prediction (DRP) using cancer cell lines plays a vital role in stratified medicine and drug discovery. Recently there has been a surge of new deep learning (DL) models for DRP that show promising performance improvements. However, different models use different input data modalities and neural network architectures making it hard to find the source of these improvements. Results We consider three DL DRP models with reported state-of-the-art performance and use genomics or transcriptomics profiles of cell lines and chemical profiles of drugs as input data. We also construct null hypothesis benchmarks that simply leverage patterns in truth values and thus do not use omics or chemical profiles. By experimenting with these DL models and comparing them with our null hypothesis benchmarks we show that for multiple testing types, much or all of the current reported performance is a property of the training truth values. Furthermore, we show that for cancer blind testing (testing on unseen cell lines) no performance comes from drug features, instead, performance is due to the transcriptomics cell line profiles.

ABSTRACT Alterations induced by maternal immune activation (MIA) during gestation impact the subsequent neurodevelopment of progeny, a process that in humans, has been linked to the development of several neuropsychiatric conditions. To undertake a comprehensive examination of the molecular mechanisms governing MIA, we have devised an in vitro model based on neural stem cells (NSCs) sourced from fetuses carried by animals subjected to Poly I:C treatment. These neural progenitors demonstrate proliferative capacity and can be effectively differentiated into both neurons and glial cells. Transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic analyses conducted on these cellular models, in conjunction with counterparts from control treatments, revealed discernible shifts in the expression levels of a specific subset of proteins implicated in neuronal function. Noteworthy, we found an absence of congruence between these alterations at the transcriptomic level, suggesting that differences in protein translation contribute to the observed dysregulation. Furthermore, the phosphoproteomic data highlighted a discernible discrepancy in the basal phosphorylation of proteins between differentiated cells from both experimental groups, particularly within proteins associated with cytoskeletal architecture and synaptic functionality, notably those belonging to the MAP family. Observed alterations in MAP phosphorylation were found to potentially have functional consequences as they correlate with changes in neuronal plasticity and the establishment of neuronal synapses. Our data agrees with previous published observations and further underscore the importance of MAP2 phosphorylation state on its function and the impact that this protein has in neuronal structure and function.