Histone H3 (H3) phosphorylation at Ser(10) occurs during mitosis in eukaryotes and was recently shown to play an important role in chromosome condensation in Tetrahymena. When producing monoclonal antibodies that recognize glial fibrillary acidic protein phosphorylation at Thr(7), we obtained some monoclonal antibodies that cross-reacted with early mitotic chromosomes. They reacted with 15-kDa phosphoprotein specifically in mitotic cell lysate. With microsequencing, this phosphoprotein was proved to be H3. Mutational analysis revealed that they recognized H3 Ser(28) phosphorylation. Then we produced a monoclonal antibody, HTA28, using a phosphopeptide corresponding to phosphorylated H3 Ser(28). This antibody specifically recognized the phosphorylation of H3 Ser(28) but not that of glial fibrillary acidic protein Thr(7). Immunocytochemical studies with HTA28 revealed that Ser(28) phosphorylation occurred in chromosomes predominantly during early mitosis and coincided with the initiation of mitotic chromosome condensation. Biochemical analyses using (32)P-labeled mitotic cells also confirmed that H3 is phosphorylated at Ser(28) during early mitosis. In addition, we found that H3 is phosphorylated at Ser(28) as well as Ser(10) when premature chromosome condensation was induced in tsBN2 cells. These observations suggest that H3 phosphorylation at Ser(28), together with Ser(10), is a conserved event and is likely to be involved in mitotic chromosome condensation.

Abstract Formation of one procentriole next to each pre-existing centriole is essential for centrosome duplication, robust bipolar spindle assembly and maintenance of genome integrity. However, the mechanisms maintaining strict control over centriole copy number are incompletely understood. Here we show that Plk4 and STIL, the key regulators of centriole formation, form a protein complex that provides a scaffold for recruiting HsSAS-6, a major component of the centriolar cartwheel, at the onset of procentriole formation. Furthermore, we demonstrate that phosphorylation of STIL by Plk4 facilitates the STIL/HsSAS-6 interaction and centriolar loading of HsSAS-6. We also provide evidence that negative feedback by centriolar STIL regulates bimodal centriolar distribution of Plk4 and seemingly restricts occurrence of procentriole formation to one site on each parental centriole. Overall, these findings suggest a mechanism whereby coordinated action of three critical factors ensures formation of a single procentriole per parental centriole.

Claspin, known to be highly disordered, plays important roles in replication fork progression, initiation and cellular responses to replication stress. However, regulation of its structure and molecular interactions is not completely understood. We show here, through Proximity-Ligation-Assays, the evidence for intramolecular interaction between the N- and C-terminal segments of Claspin, which depends on the Acidic-Patch [AP] segment near its C-terminus. Interaction of Claspin with DNA and replication factors is highly stimulated in deltaAP mutant and by prior dephosphorylation. The wild-type Claspin inhibits the helicase activity of MCM in an AP-dependent manner. DeltaAP and dephosphorylated Claspin exhibit resistance to trypsin digestion compared to wild-type, suggesting the presence of structural domains in the formers. We propose that Claspin is converted from disordered (closed) to structured (open) conformation at initiation, which stimulates its DNA binding and interaction with replication factors and counteracts its helicase inhibitory activity to trigger initiation of DNA replication.

Abstract Lamellipodia are sheet-like cellular protrusions crucial for cell migration and endocytosis; their ultrastructure has been extensively studied using electron microscopy. However, the ultrastructure of the actin cytoskeleton during lamellipodia formation remains underexplored. Here, we employed the optogenetic tool PA-Rac1 combined with cryo-electron tomography (cryo-ET) to precisely control Rac1 activation and subsequent freezing via blue light irradiation. This approach enabled detailed structural analysis of newly formed lamellipodia in cells with intact plasma membranes. We successfully visualized lamellipodia with varying degrees of extension, representing different stages of lamellipodia formation. In minor extensions, several unbundled actin filaments formed “Minor protrusions” at several points along the leading edge. For moderately extended lamellipodia, cross-linked actin filaments formed small filopodia-like structures, termed “mini filopodia.” In the most extended lamellipodia, filopodia matured at multiple points along the leading edge, and the number of cross-linked actin filaments running nearly parallel to the leading edge increased throughout the lamellipodia. These observations suggest that actin polymerization begins in specific plasma membrane regions, forming mini filopodia that either mature into full filopodia or detach from the leading edge to form parallel filaments. This turnover of actin structures likely drives lamellipodial protrusion and stabilizes the base, providing new insights into the structural dynamics of the actin cytoskeleton and the mechanisms driving cell migration.