Cytochrome bd from Mycobacterium tuberculosis (Mtbd) is a menaquinol oxidase that has gained considerable interest as an antibiotic target due to its importance in survival under infectious conditions. Mtbd contains a characteristic disulfide bond that has been hypothesized to confer a redox regulatory role during infection by constraining the movement of the menaquinone-binding Q-loop. Interference of reductants used in the standard activity assay of quinol oxidases has prevented testing of this hypothesis. Here, the role of the disulfide bond and quinone specificity of Mtbd has been determined by the reconstitution of a minimal respiratory chain consisting of a NADH dehydrogenase and Mtbd, both in detergent and native-like lipid environments. Comparison to cytochrome bd from Escherichia coli (Ecbd) confirms that Mtbd is under tight redox regulation and is selective for menaquinol, unable to oxidize either ubiquinol or demethylmenaquinol. Reduction of the Mtbd disulfide bond resulted in a decrease in oxidase activity up to 90%, depending on menaquinol concentrations. In addition, the catalytic rates of Ecbd and Mtbd are over 10 times lower with the natural lipophilic quinones in comparison to their often-used hydrophilic analogs. Additionally, unlike Ecbd, the activity of Mtbd is substrate inhibited at physiologically relevant menaquinol concentrations. We signify Mtbd as the first redox sensory terminal oxidase and propose that this enables Mtbd to adapt its activity in defence against reactive oxygen species encountered during infection by M. tuberculosis.

Abstract Biology provides a suite of optically-active nanomaterials in the form of “light harvesting” protein-chlorophyll complexes, however, these have drawbacks including their limited spectral range. We report the generation of model lipid membranes (proteoliposomes) incorporating the photosynthetic protein Light-Harvesting Complex II (LHCII) and lipid-tethered Texas Red (TR) chromophores that act as a “bio-hybrid” energy transferring nanomaterial. The effective spectral range of the protein is enhanced due to highly efficient energy transfer from the TR chromophores (up to 94%), producing a marked increase in LHCII fluorescence (up to 3x). Our self-assembly procedure offers excellent modularity allowing the incorporation of a range of concentrations of energy donors (TR) and acceptors (LHCII), allowing the energy transfer efficiency (ETE) and LHCII fluorescence to be tuned as desired. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) provides single-proteoliposome-level quantification of ETE, revealing distributions within the population and proving that functionality is maintained on a surface. Our membrane-based system acts as a controllable light harvesting nanomaterial with potential applications as thin films in photo-active devices. Table of Contents Figure

Abstract Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are homodimeric proteins that hydrolyse pyrophosphate and pump H + /Na + across membranes. They are crucial for the virulence of protist pathogens, making them attractive drug targets. In this study, we investigate the inhibitory effects of seven distinct bisphosphonates against Thermotoga maritima mPPase to explore their mode of action and assist in future small molecule inhibitor development. We solved two structures of mPPase bound to the inhibitors in the enzyme active sites and probed the conformational dynamics of mPPase under multiple inhibitors and functionally relevant conditions by double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy. We found that mPPase adopts five distinct conformations within the ensemble in the presence of different inhibitors. Combined with solid-supported membrane-based electrophysiology recordings, this revealed that during catalysis, one monomer of the dimer remains open, and Na + can only be pumped in a closed state. These results further support the existence of catalytic asymmetry in our pumping-before-hydrolysis model.

Abstract Membrane-bound pyrophosphatases (M-PPases) are homodimeric primary ion pumps that couple the transport of Na + - and/or H + across membranes to the hydrolysis of pyrophosphate. Their role in the virulence of protist pathogens like Plasmodium falciparum makes them an intriguing target for structural and functional studies. Here, we show the first structure of a K + -independent M-PPase, asymmetric and time-dependent substrate binding in time-resolved structures of a K + -dependent M-PPase, and demonstrate pumping-before-hydrolysis by electrometric studies. We suggest how key residues in helix 12, 13, and the exit channel loops affect ion selectivity and K + -activation due to a complex interplay of residues that are involved in subunit-subunit communication. Our findings not only explain ion selectivity in M-PPases but also why they display half-of-the-sites reactivity. Based on this we propose, for the first time, a unified and testable model for ion pumping, hydrolysis, and energy-coupling in all M-PPases, including those that pump both Na + and H + .