Summary Cytoplasmic RNA-protein (RNP) granules have diverse biophysical properties, from liquid to solid, and play enigmatic roles in RNA metabolism. Nematode P-granules are paradigmatic liquid droplet granules and central to germ cell development. Here we analyze a key P-granule scaffolding protein, called PGL, to investigate the functional relationship between P-granule assembly and function. Using a protein-RNA tethering assay, we find that reporter mRNA expression is repressed when recruited to PGL granules. We determine the crystal structure of the PGL N-terminal region to 1.5 Å, discover its dimerization and identify key residues at the dimer interface. In vivo mutations of those interface residues prevent P-granule assembly, de-repress PGL-tethered mRNA and reduce fertility. Therefore, PGL dimerization lies at the heart of both P-granule assembly and function. Finally, we identify the P-granule-associated Argonaute WAGO-1 as crucial for repression of PGL-tethered mRNA. We conclude that P-granule function requires both assembly and localized regulators.

RNA modifications shape gene expression through a smorgasbord of chemical changes to canonical RNA bases. Although numbering in the hundreds, only a few RNA modifications are well characterized, in part due to the absence of methods to identify modification sites. Antibodies remain a common tool to identify modified RNA and infer modification sites through straightforward applications. However, specificity issues can result in off-target binding and confound conclusions. This work utilizes in silico λ-dynamics to efficiently estimate binding free energy differences of modification-targeting antibodies between a variety of naturally occurring RNA modifications. Crystal structures of inosine and N6-methyladenosine (m 6 A) targeting antibodies bound to their modified ribonucleosides were determined and served as structural starting points. λ-Dynamics was utilized to predict RNA modifications that permit or inhibit binding to these antibodies. In vitro RNA-antibody binding assays supported the accuracy of these in silico results. High agreement between experimental and computed binding propensities demonstrated that λ-dynamics can serve as a predictive screen for antibody specificity against libraries of RNA modifications. More importantly, this strategy is an innovative way to elucidate how hundreds of known RNA modifications interact with biological molecules without the limitations imposed by in vitro or in vivo methodologies.

Engaging in research experiences as a high school or undergraduate student interested in science, technology, engineering, and mathematics (STEM) is pivotal for their academic and professional development. A structured teaching framework can help cultivate student curiosity and passion for learning and research. In this study, an effective eight-week training program has been created that encompasses fundamental molecular biology principles and hands-on laboratory activities. This curriculum focuses on using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing in the Caenorhabditis elegans model organism. Through pre- and post-program assessments, substantial enhancements in student molecular biology proficiency and enthusiasm for scientific exploration was observed. Overall, this diligently crafted training module that employs C. elegans as an educational tool to instruct inexperienced students has demonstrated its accessibility and ability to engage students in molecular biology and gene editing methodologies.

Metazoan germ cells develop as sperm or oocytes, depending on chromosomal sex, extrinsic signaling from somatic tissue and intrinsic factors within the germ cells. Gamete fate regulatory networks have been analyzed in nematodes, flies and mammals, but only in C. elegans have terminal intrinsic regulators been identified, which include a Tob/BTG protein family member, FOG-3. Canonical Tob/BTG proteins function as monomeric adaptor proteins that link RNA binding proteins to deadenylases. To ask if FOG-3 functions similarly, we first determined its crystal structure. FOG-3 harbors a classical Tob/BTG fold, but unlike other Tob/BTG proteins, FOG-3 dimerizes and these FOG-3 dimers assemble into polymers. The importance of FOG-3 polymers to sperm fate specification was confirmed in vivo using CRISPR/Cas9 gene editing to create mutations designed to disrupt the polymer interface. The FOG-3 surface potential is highly basic, suggesting binding to nucleic acid. We find that FOG-3 binds RNA directly with a strong preference for 3'UTRs of oogenic mRNAs. Our results reveal a divergent but striking molecular assembly for proteins with a Tob/BTG fold, make key advances in understanding the mechanism of sperm fate specification and highlight the potential for undiscovered protein polymers in biology.

Post-baccalaureate (post-bac) programs can have a positive impact on science training and STEM career opportunities for junior trainees. A goal for many of these sponsored programs is to increase research exposure for underrepresented minorities, a group that can include African American, Hispanic, Native American, and first-generation college students, among others. Recruiting underrepresented minorities to post-bac programs can be challenging, for reasons that include a lack of available research opportunities, time to pursue these experiences, and awareness of available programs. To this end, an Open House event was created to inform and excite potential students for future post-bac programs. Students were recruited from partnering Minority Serving Institutions (MSIs) to attend a two-day event at a primarily undergraduate institution (PUI) and a research-intensive R1 institution. The students visited both campuses, were informed about post-bac programs and potential research opportunities, and met with faculty, current graduate students, and a former post-bac scholar. Transportation, lodging, and meals were provided. Visiting students completed voluntary pre- and post-surveys. Results indicated that attendees, the majority of whom were underrepresented minorities in STEM, left the event with an increased understanding about post-bac programs and their benefits to a career in STEM and that their attendance at the event made it more likely they would apply to available post-bac programs. Thus, this work demonstrates that in-person events involving integrative partnerships across multiple universities are effective strategies for increasing awareness of opportunities available to students post-graduation and for recruiting underrepresented groups in STEM to post-bac programs.

Abstract Robust methods are critical for testing the in vivo regulatory mechanism of RNA binding proteins. Here we report improvement of a protein-mRNA tethering assay to probe the function of an RNA binding protein in its natural context within the C. elegans adult germline. The assay relies on a dual reporter expressing two mRNAs from a single promoter and resolved by trans-splicing. The gfp reporter 3’UTR harbors functional binding elements for λN22 peptide, while the mCherry reporter 3’UTR carries mutated nonfunctional elements. This strategy enables internally controlled quantitation of reporter protein by immunofluorescence and mRNA by smFISH. To test the new system, we analyzed a C. elegans Nanos protein, NOS-3, which serves as a post-transcriptional regulator of germ cell fate. Unexpectedly, tethered NOS-3 enhanced reporter expression. We confirmed this enhancement activity with a second reporter engineered at an endogenous germline gene. NOS-3 enhancement of reporter expression was associated with its N-terminal intrinsically disordered region, not its C-terminal zinc fingers. RNA quantitation revealed that tethered NOS-3 enhances stability of the reporter mRNA. We suggest that this direct NOS-3 enhancement activity may explain a paradox: classically Nanos proteins are expected to repress RNA, but nos-3 had been found to promote gld-1 expression, an effect that could be direct. Regardless, the new dual reporter dramatically improves in situ quantitation of reporter expression after RBP tethering to determine its molecular mechanism in a multicellular tissue.