This chapter presents the procedure for preparation of high molecular weight RNA. High molecular weight RNA can be isolated from haploid or diploid yeast cells as well as from ascospores. The conditions under which the yeast cells are grown (complete or selective media) do not influence the preparation procedure, although higher yields of RNA are generally obtained from cells grown in rich medium. Procedure requires some special precautions owing to the ubiquitous presence of RNA-degrading enzymes. For this reason it is important to wear gloves during the isolation and preparation procedure, and it is essential to separate all chemicals, tubes, and tips used for RNA preparation from commonly used materials. All glassware has to be baked for 2 hr at 200°; commercially available sterile plastic tubes or tips do not have to be specially pretreated, because they seem to be free of fibonucleases. Because the degradation of RNA by RNases is a time-dependent reaction, it is also advisable to work as fast as possible.

Abstract Fast and reliable detection of patients with severe and heterogeneous illnesses is a major goal of precision medicine 1,2 . Patients with leukaemia can be identified using machine learning on the basis of their blood transcriptomes 3 . However, there is an increasing divide between what is technically possible and what is allowed, because of privacy legislation 4,5 . Here, to facilitate the integration of any medical data from any data owner worldwide without violating privacy laws, we introduce Swarm Learning—a decentralized machine-learning approach that unites edge computing, blockchain-based peer-to-peer networking and coordination while maintaining confidentiality without the need for a central coordinator, thereby going beyond federated learning. To illustrate the feasibility of using Swarm Learning to develop disease classifiers using distributed data, we chose four use cases of heterogeneous diseases (COVID-19, tuberculosis, leukaemia and lung pathologies). With more than 16,400 blood transcriptomes derived from 127 clinical studies with non-uniform distributions of cases and controls and substantial study biases, as well as more than 95,000 chest X-ray images, we show that Swarm Learning classifiers outperform those developed at individual sites. In addition, Swarm Learning completely fulfils local confidentiality regulations by design. We believe that this approach will notably accelerate the introduction of precision medicine.

ABSTRACT Leaves are asymmetric, with differential functionalization of abaxial and adaxial tissues. The bundle sheath (BS) surrounding the vasculature of the C3 crop barley is dorsoventrally differentiated into three domains: adaxial structural, lateral S-type, and abaxial L-type. S-type cells seem to transfer assimilates towards the phloem. Here we used single-cell RNA sequencing to investigate BS differentiation in C4 maize. Abaxial BS ( ab BS) cells of rank-2 intermediate veins specifically expressed three SWEET sucrose uniporters ( SWEET13a, b , and c ) and UmamiT amino acid efflux transporters. SWEET13a, b, c were also identified in the phloem parenchyma (PP). Thus maize acquired a unique mechanism for phloem loading in which ab BS cells provide the main pathway for apoplasmic sucrose transfer towards the phloem. This pathway predominates in veins responsible for phloem loading (rank-2 intermediate), while rank-1 intermediate and major veins export sucrose from the phloem parenchyma (PP) adjacent to the sieve element companion cell (SE/CC) complex, as in Arabidopsis. We surmise that ab BS identity is subject to dorsoventral patterning and has components of PP identity. These observations provide first insights into the unique transport-specific properties of ab BS cells and support for a modification to the canonical phloem loading pathway of maize, which may be generalizable to other C4 monocots.

Abstract Accurate and comprehensive immunogenetic reference panels are key to the successful implementation of population-scale immunogenomics. The 5Mbp Major Histocompatibility Complex (MHC) is the most polymorphic region of the human genome and associated with multiple immune-mediated diseases, transplant matching and therapy responses. Analysis of MHC genetic variation is severely complicated by complex patterns of sequence variation, linkage disequilibrium and a lack of fully resolved MHC reference haplotypes, increasing the risk of spurious findings on analyzing this medically important region. Integrating Illumina and ultra-long Nanopore sequencing as well as bespoke bioinformatics, we completed five of the alternative MHC reference haplotypes of the current (B38) build of the human reference genome and added one other. The six assembled MHC haplotypes encompass the DR1 and DR4 haplotype structures in addition to the previously completed DR2 and DR3, as well as six distinct classes of the structurally variable C4 region. Analysis of the assembled haplotypes showed that MHC class II sequence structures, including repeat element positions, are generally conserved within the DR haplotype supergroups, and that sequence diversity peaks in three regions around HLA-A, HLA-B+C, and the HLA class II genes. Demonstrating the potential for improved short-read analysis, the number of proper read pairs recruited to the MHC was found to be increased by 0.32% – 0.69% in a 1000 Genomes Project read re-mapping experiment with seven diverse samples. Furthermore, the assembled haplotypes can serve as references for the community and provide the basis of a structurally accurate genotyping graph of the complete MHC region.

Unicellular green algae of the genus Coccomyxa are recognized for their worldwide distribution and ecological versatility. Most species described to date live in close association with various host species, such as in lichen associations. However, little is known about the molecular mechanisms that drive such symbiotic lifestyles. We generated a high-quality genome assembly for the lichen photobiont Coccomyxa viridis SAG 216-4 (formerly C. mucigena). Using long-read PacBio HiFi and Oxford Nanopore Technologies in combination with chromatin conformation capture (Hi-C) sequencing, we assembled the genome into 21 scaffolds with a total length of 50.9 Mb, an N50 of 2.7 Mb and a BUSCO score of 98.6%. While 19 scaffolds represent full-length nuclear chromosomes, two additional scaffolds represent the mitochondrial and plastid genomes. Transcriptome-guided gene annotation resulted in the identification of 13,557 protein-coding genes, of which 68% have annotated PFAM domains and 962 are predicted to be secreted.

Unicellular green algae of the genus Coccomyxa are recognized for their worldwide distribution and ecological versatility. Most species described to date live in close association with various host species, such as in lichen associations. However, little is known about the molecular mechanisms that drive such symbiotic lifestyles. We generated a high-quality genome assembly for the lichen photobiont Coccomyxa viridis SAG 216-4 (formerly C. mucigena). Using long-read PacBio HiFi and Oxford Nanopore Technologies in combination with chromatin conformation capture (Hi-C) sequencing, we assembled the genome into 21 scaffolds with a total length of 50.9 Mb, an N50 of 2.7 Mb and a BUSCO score of 98.6%. While 19 scaffolds represent full-length nuclear chromosomes, two additional scaffolds represent the mitochondrial and plastid genomes. Transcriptome-guided gene annotation resulted in the identification of 13,557 protein-coding genes, of which 68% have annotated PFAM domains and 962 are predicted to be secreted.

Summary The microbiome greatly affects health and wellbeing. Evolutionarily, it is doubtful that a host would rely on chance alone to pass on microbial colonization to its offspring. However, the literature currently offers inconclusive evidence regarding two alternative hypotheses: active microbial shaping by host genetic factors or transmission of a microbial maternal legacy. To untangle the influence of host genetics and maternal inheritance, we collected 2-cell stage embryos from two representative wildtypes, C57BL6/J and BALB/c, and transferred a mixture of both genotype embryos into hybrid recipient mice to be inoculated by an identical microbiome at birth. Observing the offspring for six generations unequivocally emphasizes the impact of host genetic factors over maternal legacy in constant environments, akin to murine laboratory experiments. Interestingly, maternal legacy solely controlled the microbiome in the first offspring generation. However, current evidence supporting maternal legacy has not extended beyond this initial generation, resolving the aforementioned debate. graphical abstract

Abstract The positioning of limbs along the anterior-posterior axis varies widely across vertebrates. The mechanisms controlling this feature remain to be fully understood. For over 30 years, it has been speculated that Hox genes play a key role in this process but evidence supporting this hypothesis has been largely indirect. In this study, we employed loss- and gain-of-function Hox gene variants in chick embryos to address this issue. Using this approach, we found that Hox4/5 genes are necessary but insufficient for forelimb formation. Within the Hox4/5 expression domain, Hox6/7 genes are sufficient for reprogramming of neck lateral plate mesoderm to form an ectopic limb bud, thereby inducing forelimb formation anterior to the normal limb field. Our findings demonstrate that the forelimb program depends on the combinatorial actions of these Hox genes. We propose that during the evolutionary emergence of the neck, Hox4/5 provide permissive cues for forelimb formation throughout the neck region, while the final position of the forelimb is determined by the instructive cues of Hox6/7 in the lateral plate mesoderm. Impact statement Elucidation of the Hox code defining forelimb positioning provides novel insights in lateral plate mesoderm patterning and the integration of vertebrate column structure and limb positioning. Classification Development --- developmental biology

Abstract Cardiac fibroblasts (CF) are key players after myocardial infarction (MI), but their signaling is only incompletely understood. Here we report a first secretome atlas of CF in control (cCF) and post-MI hearts (miCF), combining a rapid cell isolation technique with SILAC and click chemistry. In CF, numerous paracrine factors involved in immune homeostasis were identified. Comparing secretome, transcriptome (SLAMseq), and cellular proteome disclosed protein turnover. In miCF at day 5 post-MI, significantly upregulated proteins included SLIT2, FN1, and CRLF1 in mouse and human samples. Comparing the miCF secretome at day 3 and 5 post-MI showed the dynamic nature of protein secretion. Specific in-vivo labeling of miCF proteins via biotin ligase TurboID using the POSTN promotor mirrored the in-vitro data. In summary, we have identified numerous paracrine factors specifically secreted from CF in mice and humans. This secretome atlas may lead to new biomarkers and/or therapeutic targets for the activated CF.

Abstract Beauvericin (BEA), a mycotoxin of the enniatin family produced by various toxigenic fungi, has been attributed multiple biological activities such as anti-cancer, anti-inflammatory, and anti-microbial functions. However, effects of BEA on dendritic cells remain unknown so far. Here, we identified effects of BEA on murine granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-cultured bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) and the underlying molecular mechanisms. BEA potently activates BMDCs as signified by elevated IL-12 and CD86 expression. Multiplex immunoassays performed on myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) and toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain containing adaptor inducing interferon beta (TRIF) single or double deficient BMDCs indicate that BEA induces inflammatory cytokine and chemokine production in a MyD88/TRIF dependent manner. Furthermore, we found that BEA was not able to induce IL-12 or IFNβ production in Toll-like receptor 4 ( Tlr4 )-deficient BMDCs, whereas induction of these cytokines was not compromised in Tlr3/7/9 deficient BMDCs. This suggests that TLR4 might be the functional target of BEA on BMDCs. Consistently, in luciferase reporter assays BEA stimulation significantly promotes NF-κB activation in mTLR4/CD14/MD2 overexpressing but not control HEK-293 cells. RNA-sequencing analyses further confirmed that BEA induces transcriptional changes associated with the TLR4 signaling pathway. Together, these results identify TLR4 as a cellular BEA sensor and define BEA as a potent activator of BMDCs, implying that this compound can be exploited as a promising candidate structure for vaccine adjuvants or cancer immunotherapies.