ABSTRACT The correct patterning of vertebrate skeletal elements is controlled by inductive interactions. Two vertebrate hedgehog proteins, Sonic hedgehog and Indian hedgehog, have been implicated in skeletal development. During somite differentiation and limb development, Sonic hedgehog functions as an inductive signal from the notochord, floor plate and zone of polarizing activity. Later in skeletogenesis, Indian hedgehog functions as a regulator of chondrogenesis during endochondral ossification. The vertebrate Gli zinc finger proteins are putative transcription factors that respond to Hedgehog signaling. In Drosophila, the Gli homolog cubitus interruptus is required for the activation of hedgehog targets and also functions as a repressor of hedgehog expression. We show here that Gli2 mutant mice exhibit severe skeletal abnormalities including cleft palate, tooth defects, absence of vertebral body and intervertebral discs, and shortened limbs and sternum. Interestingly, Gli2 and Gli3 (C.-c. Hui and A. L. Joyner (1993). Nature Genet. 3, 241-246) mutant mice exhibit different subsets of skeletal defects indicating that they implement specific functions in the development of the neural crest, somite and lateral plate mesoderm derivatives. Although Gli2 and Gli3 are not functionally equivalent, double mutant analysis indicates that, in addition to their specific roles, they also serve redundant functions during skeletal development. The role of Gli2 and Gli3 in Hedgehog signaling during skeletal development is discussed.

SUMMARY Transition from smooth, lissencephalic brains to highly-folded, gyrencephalic structures is associated with neuronal expansion and breaks in neurogenic symmetry. Here we show that Neurog2 and Ascl1 proneural genes regulate cortical progenitor cell differentiation through cross-repressive interactions to sustain neurogenic continuity in a lissencephalic rodent brain. Using in vivo lineage tracing, we found that Neurog2 and Ascl1 expression defines a lineage continuum of four progenitor pools, with ‘double + progenitors’ displaying several unique features (least lineage-restricted, complex gene regulatory network, G 2 pausing). Strikingly, selective killing of double + progenitors using split-Cre; Rosa-DTA transgenics breaks neurogenic symmetry by locally disrupting Notch signaling, leading to cortical folding. Finally, consistent with NEUROG2 and ASCL1 driving discontinuous neurogenesis and folding in gyrencephalic species, their transcripts are modular in folded macaque cortices and pseudo-folded human cerebral organoids. Neurog2 / Ascl1 double + progenitors are thus Notch-ligand expressing ‘niche’ cells that control neurogenic periodicity to determine cortical gyrification. HIGHLIGHTS Neurog2 and Ascl1 expression defines four distinct transitional progenitor states Double + NPCs are transcriptionally complex and mark a lineage branch point Double + NPCs control neurogenic patterning and cortical folding via Notch signaling Neurog2 and Ascl1 expression is modular in folded and not lissencephalic cortices eTOC BLURB Emergence of a gyrencephalic cortex is associated with a break in neurogenic continuity across the cortical germinal zone. Han et al. identify a pool of unbiased neural progenitors at a lineage bifurcation point that co-express Neurog2 and Ascl1 and produce Notch ligands to control neurogenic periodicity and cortical folding.

ABSTRACT Unique hallmarks of human neocortical development include slower rates of neurogenesis and the establishment of an extracellular matrix-rich, outer-subventricular zone that supports basal neural progenitor cell expansion. How gene regulatory networks have evolved to support these human-specific neurodevelopmental features is poorly understood. Mining single cell data from cerebral organoids and human fetal cortices, we found that NEUROG2 expression is enriched in basal neural progenitor cells. To identify and purify NEUROG2 -expressing cells and trace their short-term lineage, we engineered two NEUROG2-mCherry knock-in human embryonic stem cell lines to produce cerebral organoids. Transcriptomic profiling of mCherry-high organoid cells revealed elevated expression of PPP1R17 , associated with a fast-evolving human-accelerated regulatory region, oligodendrocyte precursor cell and extracellular matrix-associated gene transcripts. Conversely, only neurogenic gene transcripts were enriched in mCherry-high cortical cells from Neurog2:mCherry knock-in mice. Finally, we show that Neurog2 is sufficient to induce Ppp1r17 , which slows human neural progenitor cell division, and Col13a1 , an extracellular matrix gene, in P19 cells. NEUROG2 thus regulates a human neurodevelopmental gene regulatory program implicated in supporting a pro-proliferative basal progenitor cell niche and tempering the neurogenic pace. SUMMARY STATEMENT Transcriptomic analyses of NEUROG2-mCherry knock-in human embryonic stem cell-derived cerebral organoids reveal a link between NEUROG2 and extracellular matrix remodeling during human cortical development.

ABSTRACT Neocortical neural progenitor cells (NPCs) are molecularly heterogeneous, yet the genes that confer distinct neuronal morphologies and connectivities during development are poorly understood. Here, we determined that a proneural gene combinatorial code diversifies cortical NPCs. By mining scRNA-seq data from murine embryonic and early postnatal cortices and generating trajectory inference models, we found that Neurog2 is predominant, and is transiently co-expressed with Ascl1 and/or Neurog1 during an apical-to-basal NPC transition state in NPCs with early pseudotime identities. To assess whether proneural gene pairs confer distinct properties, we first used Neurog2/Ascl1 reporter mice expressing unique reporters, revealing that NPCs have distinct cell division modes and cell cycle dynamics dependent on their proneural gene profile. To assess Neurog2/Neurog1 interactions, we used double knock-out mice and novel split-Cre transgenics crossed to a Rosa-diptheria-toxin-A line to delete double + cells, showing Neurog1/Neurog2 are specifically required to generate early-born neurons and to maintain NPCs. Finally, in silico mutation of a cortical Neurog2-gene regulatory network and validation using Neurog1/Neurog2 mutant and ‘deleter’ mice, identified Bclllb and Nhlh2, expressed in early-born neurons, as dependent on Neurog1/Neurog2. Our data explains how proneural genes act combinatorically to diversify gene regulatory networks, thereby lineage restricting NPCs and creating cortical neuronal diversity.

Abstract Isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant gliomas, including oligodendroglioma (IDH-O) and astrocytoma (IDH-A), have signature slow-growth rates that are poorly understood. Here, we reveal that SMPD3, a ceramide-producing sphingomyelinase implicated as a tumor suppressor gene and involved in extracellular vesicle biogenesis, suppresses IDH-mutant tumor growth via autocrine and paracrine actions. In patients with IDH-mutant gliomas, higher SMPD3 expression levels correlate with longer survival, consistent with ceramide acting as an anti-oncometabolite. SMPD3 knock-down in patient-derived IDH-O cells enhances proliferation cell-autonomously in 2D-culture and 3D-human cerebral organoids, and accelerates tumor growth in mouse orthotopic xenografts. Supporting paracrine actions, IDH-O-derived extracellular vesicles, enriched in ribosomal proteins, induce astrocytic death in vitro . Furthermore, non-neoplastic glia in IDH-O tumors proliferate abnormally yet undergo apoptosis, concomitant with the acquisition of a translation-enriched transcriptional signature by tumor-associated oligodendrocytes. SMPD3 thus suppresses IDH-mutant glioma growth cell-autonomously and phenotypically alters normal glia via extracellular vesicle biogenesis and paracrine actions.