Yersinia pseudotuberculosis is a Gram-negative bacterium and zoonotic pathogen responsible for a wide range of diseases, ranging from mild diarrhea, enterocolitis, lymphatic adenitis to persistent local inflammation. The Y. pseudotuberculosis invasin D (InvD) molecule belongs to the invasin (InvA)-type autotransporter proteins, but its structure and function remain unknown. In this study, we present the first crystal structure of InvD, analyzed its expression and function in a murine infection model, and identified its target molecule in the host. We found that InvD is induced at 37 °C and expressed in vivo 2–4 days after infection, indicating that InvD is a virulence factor. During infection, InvD was expressed in all parts of the intestinal tract, but not in deeper lymphoid tissues. The crystal structure of the C-terminal adhesion domain of InvD revealed a distinct Ig-related fold that, apart from the canonical β-sheets, comprises various modifications of and insertions into the Ig-core structure. We identified the Fab fragment of host-derived IgG/IgA antibodies as the target of the adhesion domain. Phage display panning and flow cytometry data further revealed that InvD exhibits a preferential binding specificity toward antibodies with VH3/VK1 variable domains and that it is specifically recruited to a subset of B cells. This finding suggests that InvD modulates Ig functions in the intestine and affects direct interactions with a subset of cell surface-exposed B-cell receptors. In summary, our results provide extensive insights into the structure of InvD and its specific interaction with the target molecule in the host. Yersinia pseudotuberculosis is a Gram-negative bacterium and zoonotic pathogen responsible for a wide range of diseases, ranging from mild diarrhea, enterocolitis, lymphatic adenitis to persistent local inflammation. The Y. pseudotuberculosis invasin D (InvD) molecule belongs to the invasin (InvA)-type autotransporter proteins, but its structure and function remain unknown. In this study, we present the first crystal structure of InvD, analyzed its expression and function in a murine infection model, and identified its target molecule in the host. We found that InvD is induced at 37 °C and expressed in vivo 2–4 days after infection, indicating that InvD is a virulence factor. During infection, InvD was expressed in all parts of the intestinal tract, but not in deeper lymphoid tissues. The crystal structure of the C-terminal adhesion domain of InvD revealed a distinct Ig-related fold that, apart from the canonical β-sheets, comprises various modifications of and insertions into the Ig-core structure. We identified the Fab fragment of host-derived IgG/IgA antibodies as the target of the adhesion domain. Phage display panning and flow cytometry data further revealed that InvD exhibits a preferential binding specificity toward antibodies with VH3/VK1 variable domains and that it is specifically recruited to a subset of B cells. This finding suggests that InvD modulates Ig functions in the intestine and affects direct interactions with a subset of cell surface-exposed B-cell receptors. In summary, our results provide extensive insights into the structure of InvD and its specific interaction with the target molecule in the host.

Summary Endocytosis of extracellular or plasma membrane material is a fundamental process. A variety of endocytic pathways exist, several of which are barely understood in terms of mechanistic execution and biological function. Importantly, some mechanisms have been identified and characterized by following virus internalization into cells. This includes a novel endocytic pathway exploited by human papillomavirus type 16 (HPV16). However, its cellular role and mechanism of endocytic vacuole formation remain unclear. Here, HPV16 was used as a tool to examine the mechanistic execution of vesicle formation by combining systematic perturbation of cellular processes with electron and video microscopy. Our results indicate cargo uptake by uncoated, inward-budding pits facilitated by the membrane bending retromer protein SNX2. Actin polymerization-driven vesicle scission is promoted by WASH, an actin regulator typically not found at the plasma membrane. Uncovering a novel role of WASH in endocytosis, we propose to term the new pathway WASH-mediated endocytosis (WASH-ME).

Here, B. subtilis was used as a model organism to investigate how cells respond and adapt to proteotoxic stress conditions. Our experiments suggested that the stringent response, caused by raised levels of the (p)ppGpp alarmone, plays a role during thermotolerance development and the heat shock response. Accordingly, our experiments revealed a rapid increase of cellular (p)ppGpp levels upon heat shock as well as salt- and oxidative stress. Strains lacking (p)ppGpp exhibited increased stress sensitivity, while raised (p)ppGpp levels conferred increased stress tolerance to heat- and oxidative stress. During thermotolerance development, stress response genes were highly up-regulated together with a concurrent transcriptional down-regulation of the rRNA, which was influenced by the second messenger (p)ppGpp and the transcription fac-tor Spx. Remarkably, we observed that (p)ppGpp appeared to control the cellular translational capacity and that during heat stress the raised cellular levels of the alarmone were able to curb the rate of protein synthesis. Furthermore, (p)ppGpp controls the heat-induced expression of Hpf and thus the formation of translationally inactive 100S disomes. These results indicate that B. subtilis cells respond to heat-mediated protein unfolding and aggregation, not only by raising the cellular repair capacity, but also by decreasing translation involving (p)ppGpp medi-ated stringent response to concurrently reduce the protein load for the cellular protein quality control system.

Abstract Cytotoxic necrotizing factors (CNFs) are bacterial single-chain exotoxins that modulate cytokinetic/oncogenic and inflammatory processes through activation of host cell Rho GTPases. To achieve this, they are secreted, bind surface receptors to induce endocytosis and translocate a catalytic unit into the cytosol to intoxicate host cells. A three-dimensional structure that provides insight into the underlying mechanisms is still lacking. Here, we determined the crystal structure of full-length Yersinia pseudotuberculosis CNF Y . CNF Y consists of five domains (D1-D5), and by integrating structural and functional data we demonstrate that D1-3 act as export and translocation module for the catalytic unit (D4-5) or fused β-lactamase reporter proteins. We further found that domain D4, which possesses structural similarity to ADP-ribosyl transferases, but had no equivalent catalytic activity, changed its position to interact extensively with D5 in the crystal structure of the free D4-5 fragment. This liberates D5 from a semi-blocked conformation in full-length CNF Y , leading to higher deamidation activity. Finally, sequence comparisons identified the CNF translocation module in many uncharacterized bacterial proteins, suggesting its usability as a universal drug delivery tool.

Oral administration is a preferred model for studying infection by bacterial enteropathogens such as Yersinia . In the mouse model, the most frequent method for oral infection consists of oral gavage with a feeding needle directly introduced in the animal stomach via the esophagus. In this study, we compared needle gavage to bread feeding as an alternative mode of bacterial administration. Using a bioluminescence-expressing strain of Yersinia pseudotuberculosis , we detected very early upon needle gavage a bioluminescent signal in the neck area together with a signal in the abdominal region, highlighting the presence of two independent sites of bacterial colonization and multiplication. Bacteria were often detected in the esophagus and trachea, as well as in the lymph nodes draining the salivary glands, suggesting that lesions made during needle introduction into the animal oral cavity lead to rapid bacterial draining to proximal lymph nodes. We then tested an alternative mode of bacterial administration using small pieces of white bread containing bacteria. Upon bread feeding infection, mice exhibited a stronger bioluminescent signal in the abdominal region as compared to needle gavage, and no signal was detected in the neck area. Moreover, Y. pseudotuberculosis incorporated in the bread is less susceptible to the acidic environment of the stomach and is therefore more efficient in causing intestinal infections. Based on our observations, bread feeding constitutes a natural and more efficient administration method which does not require specialized skills, is less traumatic for the animal, and results in diseases that more closely mimic food-borne intestinal infection.

ABSTRACT Infections with enteropathogenic E. coli (EPEC) cause severe diarrhea in children. The non-invasive bacteria adhere to enterocytes of the small intestine and use a type III secretion system (T3SS) to inject effector proteins into host cells to modify and exploit cellular processes in favor of bacterial survival and replication. Several studies have shown that the T3SSs of bacterial pathogens are essential for virulence. Furthermore, the loss of T3SS-mediated effector translocation results in increased immune recognition and clearance of the bacteria. The T3SS is, therefore, considered a promising target for antivirulence strategies and novel therapeutics development. Here, we report the results of a high-throughput screening assay based on the translocation of the EPEC effector protein Tir. Using this assay, we screened more than 13,000 small molecular compounds of six different compound libraries and identified three substances which showed a significant dose-dependent effect on translocation without adverse effects on bacterial or eukaryotic cell viability. Additionally, these substances reduced bacterial binding to host cells, effector-dependent cell detachment and abolished A/E lesion formation without affecting the expression of components of the T3SS or associated effector proteins. Moreover, no effects of the inhibitors on bacterial motility or Shiga-toxin expression were observed. In summary, we have identified three new compounds that strongly inhibit T3SS-mediated translocation of effectors into mammalian cells, which could be valuable as lead substances for treating EPEC and EHEC infections.

RNA degradation is an essential process that allows bacteria to regulate gene expression and has emerged as an important mechanism for controlling virulence. However, the individual contributions of RNases in this process are mostly unknown. Here, we report that of 11 tested potential RNases of the intestinal pathogen Yersinia pseudotuberculosis, two, the endoribonuclease RNase III and the exoribonuclease PNPase, repress the synthesis of the master virulence regulator LcrF. LcrF activates the expression of virulence plasmid genes encoding the type III secretion system (Ysc-T3SS) and its substrates (Yop proteins), that are employed to inhibit immune cell functions during infection. Loss of both RNases led to an increase in lcrF mRNA levels and stability. Our work indicates that PNPase exerts its influence via YopD, known to accelerate lcrF mRNA degradation. Loss of RNase III results in the downregulation of the CsrB and CsrC RNAs, leading to increased availability of active CsrA, which has previously been shown to enhance lcrF mRNA translation and stability. Other factors that influence the translation process and were found to be differentially expressed in the RNase III-deficient mutant could support this process. Transcriptomic profiling further revealed that Ysc-T3SS-mediated Yop secretion leads to global reprogramming of the Yersinia transcriptome with a massive shift of the expression from chromosomal towards virulence plasmid-encoded genes. A similar extensive transcriptional reprogramming was also observed in the RNase III-deficient mutant under non-secretion conditions. This illustrates that RNase III enables immediate coordination of virulence traits, such as Ysc-T3SS/Yops, with other functions required for host-pathogen interactions and survival in the host.

Abstract Many bacterial pathogens use a type III secretion system (T3SS) as molecular syringe to inject effector proteins into the host cell. In the foodborne pathogen Yersinia pseudotuberculosis, delivery of the secreted effector protein cocktail through the T3SS depends on YopN, a molecular gatekeeper that controls access to the secretion channel from the bacterial cytoplasm. Here, we show that several checkpoints adjust yopN expression to virulence conditions. A dominant cue is the host body temperature. A temperature of 37 °C is known to induce the RNA thermometer (RNAT)-dependent synthesis of LcrF, a transcription factor that activates expression of the entire T3SS regulon. Here, we uncovered a second layer of temperature control. We show that another RNAT silences translation of the yopN mRNA at low environmental temperatures. The long and short 5’-untranslated region of both cellular yopN isoforms fold into a similar secondary structure that blocks ribosome binding. The hairpin structure with an internal loop melts at 37 °C and thereby permits formation of the translation initiation complex as shown by mutational analysis, in vitro structure probing and toeprinting methods. Importantly, we demonstrate the physiological relevance of the RNAT in the faithful control of type III secretion by using a point-mutated thermostable RNAT variant with a trapped SD sequence. Abrogated YopN production in this strain led to unrestricted effector protein secretion into the medium, bacterial growth arrest and delayed translocation into eukaryotic host cells. Cumulatively, our results show that substrate delivery by the Yersinia T3SS is under hierarchical surveillance of two RNATs. Author summary Temperature serves as reliable external cue for pathogenic bacteria to recognize the entry into or exit from a warm-blooded host. At the molecular level, a temperature of 37 °C induces various virulence-related processes that manipulate host cell physiology. Here, we demonstrate the temperature-dependent synthesis of the secretion regulator YopN in the foodborne pathogen Yersinia pseudotuberculosis , a close relative of Yersinia pestis . YopN blocks secretion of effector proteins through the type III secretion system unless host cell contact is established. Temperature-specific regulation relies on an RNA structure in the 5’-untranslated region of the yopN mRNA, referred to as RNA thermometer, which allows ribosome binding and thus translation initiation only at an infection-relevant temperature of 37 °C. A mutated variant of the thermosensor resulting in a closed conformation prevented synthesis of the molecular gatekeeper YopN and led to permanent secretion and defective translocation of virulence factors into host cells. We suggest that the RNA thermometer plays a critical role in adjusting the optimal cellular concentration of a surveillance factor that maintains the controlled translocation of virulence factors.

ABSTRACT Enterohemorrhagic E. coli causes watery to bloody diarrhea, which may progress to hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome. While early studies suggested that antibiotic treatment may worsen the pathology of an EHEC infection, recent work has shown that certain non-Shiga toxin-inducing antibiotics avert disease progression. Unfortunately, both intestinal bacterial infections and antibiotic treatment are associated with dysbiosis. This can alleviate colonization resistance, facilitate secondary infections, and potentially lead to more severe illness. To address the consequences in the context of an EHEC infection, we used the established mouse infection model organism C. rodentium ϕ stx2 dact and monitored changes in fecal microbiota composition during infection and antibiotic treatment. C. rodentium ϕ stx2 dact infection resulted in minor changes compared to antibiotic treatment. The infection caused clear alterations in the microbial community, leading mainly to a reduction of Muribaculaceae and a transient increase in Enterobacteriaceae distinct from Citrobacter . Antibiotic treatments of the infection resulted in marked and distinct variations in microbiota composition, diversity, and dispersion. Enrofloxacin and trimethoprim/sulfamethoxazole, which did not prevent Stx-mediated organ damage, had the least disruptive effects on the intestinal microbiota, while kanamycin and tetracycline, which rapidly cleared the infection, caused a severe reduction in diversity. Kanamycin treatment resulted in the depletion of all but Bacteroidetes genera, whereas tetracycline effects on Clostridia were less severe. Together, these data highlight the need to address the impact of individual antibiotics in the clinical care of life-threatening infections and consider microbiota-regenerating therapies. IMPORTANCE Understanding the impact of antibiotic treatment on enterohemorrhagic E. coli (EHEC) infections is crucial for appropriate clinical care. While discouraged by early studies, recent findings suggest certain antibiotics can impede disease progression. Here, we investigated the impact of individual antibiotics on the fecal microbiota in the context of an established EHEC mouse model using C. rodentium ϕ stx2 dact . The infection caused significant variations in the microbiota, leading to a transient increase in Enterobacteriaceae distinct from Citrobacter . However, these effects were minor compared to those observed for antibiotic treatments. Indeed, antibiotics that most efficiently cleared the infection also had the most detrimental effect on the fecal microbiota, causing a substantial reduction in microbial diversity. Conversely, antibiotics showing adverse effects or incomplete bacterial clearance had a reduced impact on microbiota composition and diversity. Taken together, our findings emphasize the delicate balance required to weigh the harmful effects of infection and antibiosis in treatment.