ABSTRACT The parasite Cryptosporidium is responsible for diarrheal disease in young children causing death, malnutrition, and growth delay. Cryptosporidium invades enterocytes where it develops in a unique intracellular niche. Infected cells exhibit profound changes in morphology, physiology and transcriptional activity. How the parasite effects these changes is poorly understood. We explored the localization of highly polymorphic proteins and found members of the C. parvum MEDLE protein family to be translocated into the cytoplasm of infected cells. All intracellular life stages engage in this export, which occurs after completion of invasion. Mutational studies defined an N-terminal host-targeting motif and demonstrated proteolytic processing at a specific leucine residue. Direct expression of MEDLE2 in mammalian cells triggered an ER stress response that was also observed during infection. Taken together, our studies reveal the presence of a Cryptosporidium secretion system capable of delivering pathogenesis factors into the infected enterocyte.

SUMMARY The intestinal parasite, Cryptosporidium , is a major contributor to global child mortality and causes opportunistic infection in immune deficient individuals. Innate resistance to Cryptosporidium , which specifically invades enterocytes, is dependent on the production of IFN-γ, yet whether enterocytes contribute to parasite control is poorly understood. In this study, utilizing the natural mouse pathogen, Cryptosporidium tyzzeri , we show that epithelial-derived IL-18 synergized with IL-12 to stimulate innate lymphoid cell (ILC) production of IFN-γ. This innate IFN-γ was required for early parasite control. Loss of STAT1 in enterocytes, but not dendritic cells or macrophages, antagonized early parasite control. Transcriptional profiling of enterocytes from infected mice identified an IFN-γ signature and enrichment of anti-microbial effectors like IDO, GBP and IRG. Deletion experiments identified a role for Irgm1/m3 in parasite control. Thus, enterocytes promote ILC production of IFN-γ that acts on enterocytes to restrict the growth of C. tyzzeri .

Abstract Cryptosporidium is a leading cause of severe diarrhea and diarrheal-related death in children worldwide. As an obligate intracellular parasite, Cryptosporidium relies on intestinal epithelial cells to provide a niche for its growth and survival, but little is known about the contributions that the infected cell makes to this relationship. Here we conducted a genome wide CRISPR/Cas9 knockout screen to discover host genes required for Cryptosporidium parvum infection and/or host cell survival. Gene enrichment analysis indicated that the host interferon response, glycosaminoglycan (GAG) and glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis are important determinants of susceptibility to C. parvum infection. Several of these pathways are linked to parasite attachment and invasion and C-type lectins on the surface of the parasite. Evaluation of transcript and protein induction of innate interferons revealed a pronounced type III interferon response to Cryptosporidium in human cells as well as in mice. Treatment of mice with IFNλ reduced infection burden and protected immunocompromised mice from severe outcomes including death, with effects that required STAT1 signaling in the enterocyte. Initiation of this type III interferon response was dependent on sustained intracellular growth and mediated by the pattern recognition receptor TLR3. We conclude that host cell intrinsic recognition of Cryptosporidium results in IFNλ production critical to early protection against this infection. Author Summary Cryptosporidium infection is an important contributor to global childhood mortality. There are currently no vaccines available, and the only drug has limited efficacy in immunocompromised individuals and malnourished children who need it most. To discover which host proteins are essential for Cryptosporidium infection, we conducted a genome wide knockout screen in human host cells. Our results confirm the importance of glycosaminoglycans on the surface of epithelial cells for attachment and invasion of the parasite. We also found that host GPI anchor biosynthesis and interferon signaling pathways were enriched by our screen. Examining the role of interferon signaling further we found a type III interferon response, IFNλ, was generated in response to infection and shown to be initiated in the infected cell. Utilizing mouse models of infection, we found that the type III interferon response was important early during infection with its induction likely preceding IFNγ, a key cytokine for the control of this infection. We also determined that TLR3 was the pattern recognition receptor responsible for IFNλ production during Cryptosporidium infection. Our work shows that IFNλ acts directly on the enterocyte and its use in treating immunocompromised mice produced striking reductions in infection.

Abstract Intestinal epithelial cell (IEC) responses to interferon (IFN) favor antiviral defense with minimal cytotoxicity, but IEC-specific factors that regulate these responses remain poorly understood. Interferon regulatory factors (IRFs) are a family of nine related transcription factors, and IRF6 is preferentially expressed by epithelial cells, but its roles in IEC immunity are unknown. In this study, CRISPR screens found that Irf6 deficiency enhanced IFN-stimulated antiviral responses in transformed mouse IECs but not macrophages. Furthermore, KO of Irf6 in IEC organoids resulted in profound changes to homeostasis and immunity gene expression. Irf6 KO organoids grew more slowly, and single-cell RNA sequencing indicated reduced expression of genes in epithelial differentiation and immunity pathways. IFN-stimulated gene expression was also significantly different in Irf6 KO organoids, with increased expression of stress and apoptosis-associated genes. Functionally, the transcriptional changes in Irf6 KO organoids were associated with increased cytotoxicity upon IFN treatment or inflammasome activation. These data indicate a previously unappreciated role for IRF6 in IEC biology, including regulation of epithelial development and moderation of innate immune responses to minimize cytotoxicity and maintain barrier function.