Prostate cancers are considered to be immunologically 'cold' tumors given the very few patients who respond to checkpoint inhibitor (CPI) therapy. Recently, enrichment of interferon-stimulated genes (ISGs) predicted a favorable response to CPI across various disease sites. The enhancer of zeste homolog-2 (EZH2) is overexpressed in prostate cancer and known to negatively regulate ISGs. In the present study, we demonstrate that EZH2 inhibition in prostate cancer models activates a double-stranded RNA-STING-ISG stress response upregulating genes involved in antigen presentation, Th1 chemokine signaling and interferon response, including programmed cell death protein 1 (PD-L1) that is dependent on STING activation. EZH2 inhibition substantially increased intratumoral trafficking of activated CD8+ T cells and increased M1 tumor-associated macrophages, overall reversing resistance to PD-1 CPI. Our study identifies EZH2 as a potent inhibitor of antitumor immunity and responsiveness to CPI. These data suggest EZH2 inhibition as a therapeutic direction to enhance prostate cancer response to PD-1 CPI.

ABSTRACT Transcriptional regulation is highly disease and cell-type specific. We performed H3K27ac chromatin immunoprecipitation and transcriptomic sequencing in primary tumors for the four different subtypes of invasive epithelial ovarian cancer (OC). Histotype-specific regulatory elements (REs) were enriched in enhancers (P<0.001). In silico prediction of putative target genes for histotype-specific REs identified genes ( WFDC2 , P=5.5×10 -5 ) and pathways (PI3K-Akt signaling, P<0.002) known to be involved in OC development. Some genes (e.g. PAX8 and CA125 ) are associated with super-enhancers (SEs) in all OCs, while others are histotype-specific, including PPP1R3B which is associated with SEs specific to clear cell OC. Integrated analysis of active chromatin landscapes with somatic single nucleotide variants (SNVs) from whole genome sequencing (WGS) of 232 primary OCs identified frequently mutated REs, including the KLF6 promoter (P=8.2×10 -8 ) and a putative enhancer at chromosome 6p22.1 (P<0.05). In high-grade serous OCs, somatic SNVs clustered in binding sites for the PAX8 binding partner TEAD4 (P=6×10 -11 ), while the collection of cis regulatory elements associated with PAX8 was the most frequently mutated set of enhancers in OC (P=0.003). Functional analyses supported our findings: Knockdown of PPP1R3B in clear cell OC cells significantly reduced intracellular glycogen content, a signature feature of this histotype; and stable knockout of a 635 bp region in the 6p22.1 enhancer induced downregulation of two predicted target genes, ZSCAN16 and ZSCAN12 (P=6.6 x 10 -4 and P=0.02). In summary, we have characterized histotype-specific epigenomic and transcriptomic landscapes in OC and defined likely functional REs based on somatic mutation analysis of ovarian tumors.

Abstract Genome-wide association studies (GWAS) have identified more than 140 prostate cancer (PrCa) risk regions which provide potential insights into causal mechanisms. Multiple lines of evidence show that a significant proportion of PrCa risk can be explained by germline causal variants that dysregulate nearby target genes in prostate-relevant tissues thus altering disease risk. The traditional approach to explore this hypothesis has been correlating GWAS variants with steady-state transcript levels, referred to as expression quantitative trait loci (eQTLs). In this work, we assess the utility of chromosome conformation capture (3C) coupled with immunoprecipitation (HiChIP) to identify target genes for PrCa GWAS risk loci. We find that interactome data confirms previously reported PrCa target genes identified through GWAS/eQTL overlap (e.g., MLPH ). Interestingly, HiChIP identified links between PrCa GWAS variants and genes well-known to play a role in prostate cancer biology (e.g., AR ) that are not detected by eQTL-based methods. We validate these findings through CRISPR interference (CRISPRi) perturbation of the variant-containing regulatory elements for NKX3-1 and AR in the LNCaP cell line. Our results demonstrate that looping data harbor additional information beyond eQTLs and expand the number of PrCa GWAS loci that can be linked to candidate susceptibility genes.

Abstract Neuroendocrine carcinomas (NEC) are tumors expressing markers of neuronal differentiation that can arise at different anatomic sites but have strong histological and clinical similarities. Here we report the chromatin landscapes of a range of human NECs and show convergence to the activation of a common epigenetic program. With a particular focus on treatment emergent neuroendocrine prostate cancer (NEPC), we analyzed cell lines, patient-derived xenograft (PDX) models and human clinical samples to show the existence of two distinct NEPC subtypes based on the expression of the neuronal transcription factors ASCL1 and NEUROD1. While in cell lines and PDX models these subtypes are mutually exclusive, single cell analysis of human clinical samples exhibit a more complex tumor structure with subtypes coexisting as separate sub-populations within the same tumor. These tumor sub-populations differ genetically and epigenetically contributing to intra- and inter-tumoral heterogeneity in human metastases. Overall our results provide a deeper understanding of the shared clinicopathological characteristics shown by NECs. Furthermore, the intratumoral heterogeneity of human NEPCs suggests the requirement of simultaneous targeting of coexisting tumor populations as a therapeutic strategy.

ABSTRACT c-MYC (MYC) is a major driver of prostate cancer tumorigenesis and progression. Although MYC is overexpressed in both early and metastatic disease and associated with poor survival, its impact on prostate transcriptional reprogramming remains elusive. We demonstrate that MYC overexpression significantly diminishes the androgen receptor (AR) transcriptional program (the set of genes directly targeted by the AR protein) in luminal prostate cells without altering AR expression. Importantly, analyses of clinical specimens revealed that concurrent low AR and high MYC transcriptional programs accelerate prostate cancer progression toward a metastatic, castration-resistant disease. Data integration of single-cell transcriptomics together with ChIP-seq revealed an increased RNA polymerase II (Pol II) promoter-proximal pausing at AR-dependent genes following MYC overexpression without an accompanying deactivation of AR-bound enhancers. Altogether, our findings suggest that MYC overexpression antagonizes the canonical AR transcriptional program and contributes to prostate tumor initiation and progression by disrupting transcriptional pause release at AR-regulated genes. STATEMENT OF SIGNIFICANCE AR and MYC are key to prostate cancer etiology but our current understanding of their interplay is scarce. Here we show that the oncogenic transcription factor MYC can pause the transcriptional program of the master transcription factor in prostate cancer, AR, while turning on its own, even more lethal program.

Abstract Lineage plasticity, the ability of a cell to alter its identity, is an increasingly common mechanism of adaptive resistance to targeted therapy in cancer 1,2 . An archetypal example is the development of neuroendocrine prostate cancer (NEPC) after treatment of prostate adenocarcinoma (PRAD) with inhibitors of androgen signaling. NEPC is an aggressive variant of prostate cancer that aberrantly expresses genes characteristic of neuroendocrine (NE) tissues and no longer depends on androgens. To investigate the epigenomic basis of this resistance mechanism, we profiled histone modifications in NEPC and PRAD patient-derived xenografts (PDXs) using chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq). We identified a vast network of cis -regulatory elements (N~15,000) that are recurrently activated in NEPC. The FOXA1 transcription factor (TF), which pioneers androgen receptor (AR) chromatin binding in the prostate epithelium 3,4 , is reprogrammed to NE-specific regulatory elements in NEPC. Despite loss of dependence upon AR, NEPC maintains FOXA1 expression and requires FOXA1 for proliferation and expression of NE lineage-defining genes. Ectopic expression of the NE lineage TFs ASCL1 and NKX2-1 in PRAD cells reprograms FOXA1 to bind to NE regulatory elements and induces enhancer activity as evidenced by histone modifications at these sites. Our data establish the importance of FOXA1 in NEPC and provide a principled approach to identifying novel cancer dependencies through epigenomic profiling.

ABSTRACT HOXB13, a homeodomain transcription factor, critically regulates androgen receptor (AR) function and promotes androgen-dependent prostate cancer (PCa) growth. However, the functions of HOXB13 in an AR-independent context remain elusive. Here we report an essential role of HOXB13 in directly suppressing lipogenic transcriptional programs in both AR-positive and -negative PCa cells. The MEIS domain (aa70-150) of HOXB13 interacts with the histone deacetylase HDAC3, which is disrupted by HOXB13 G84E mutation that has been associated with early-onset PCa. Thus, HOXB13 wildtype (WT), but not G84E mutant, recruits HDAC3 to lipogenic enhancers to catalyze histone de-acetylation and suppress lipogenic programs. HOXB13 knockdown unleashes the expression of key lipogenic regulators such as fatty acid synthase (FASN), requiring HDAC3. Analysis of human tissues revealed that HOXB13 is lost in about 30% of metastatic castration-resistant PCa, at least in part, through DNA hypermethylation. Functionally, loss of HOXB13 leads to massive lipid accumulation in PCa cells, thereby promoting cell motility in vitro and fueling xenograft tumor metastasis in vivo , which is mitigated by pharmaceutical inhibitors of FASN. In summary, our study discovers an essential AR-independent function of HOXB13 in repressing de novo lipogenesis and inhibiting tumor metastasis and defines a subclass of PCa that may benefit from lipogenic pathway inhibitors.

Abstract Sarcomatoid and rhabdoid (S/R) renal cell carcinoma (RCC) are highly aggressive tumors with limited molecular and clinical characterization. Emerging evidence suggests immune checkpoint inhibitors (ICI) are particularly effective for these tumors 1–3 , although the biological basis for this property is largely unknown. Here, we evaluate multiple clinical trial and real-world cohorts of S/R RCC to characterize their molecular features, clinical outcomes, and immunologic characteristics. We find that S/R RCC tumors harbor distinctive molecular features that may account for their aggressive behavior, including BAP1 mutations, CDKN2A deletions, and increased expression of MYC transcriptional programs. We show that these tumors are highly responsive to ICI and that they exhibit an immune-inflamed phenotype characterized by immune activation, increased cytotoxic immune infiltration, upregulation of antigen presentation machinery genes, and PD-L1 expression. Our findings shed light on the molecular drivers of aggressivity and responsiveness to immune checkpoint inhibitors of S/R RCC tumors.

ABSTRACT Advanced prostate cancers comprise distinct phenotypes, but tumor classification remains clinically challenging. Here, we harnessed circulating tumor DNA (ctDNA) to study tumor phenotypes by ascertaining nucleosome positioning patterns associated with transcription regulation. We sequenced plasma ctDNA whole genomes from patient-derived xenografts representing a spectrum of androgen receptor active (ARPC) and neuroendocrine (NEPC) prostate cancers. Nucleosome patterns associated with transcriptional activity were reflected in ctDNA at regions of genes, promoters, histone modifications, transcription factor binding, and accessible chromatin. We identified the activity of key phenotype-defining transcriptional regulators from ctDNA, including AR, ASCL1, HOXB13, HNF4G, and NR3C1. Using these features, we designed a prediction model which distinguished NEPC from ARPC in patient plasma samples across three clinical cohorts with 97-100% sensitivity and 85-100% specificity. While phenotype classification is typically assessed by immunohistochemistry or transcriptome profiling, we demonstrate that ctDNA provides comparable results with numerous diagnostic advantages for precision oncology. STATEMENT OF SIGNIFICANCE This study provides key insights into the dynamics of nucleosome positioning and gene regulation associated with cancer phenotypes that can be ascertained from ctDNA. The new methods established for phenotype classification extend the utility of ctDNA beyond assessments of DNA alterations with important implications for molecular diagnostics and precision oncology.

Renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation (sRCC) is associated with poor survival and a heightened response to immune checkpoint inhibitors (ICIs). Two major barriers to improving outcomes for sRCC are the limited understanding of its gene regulatory programs and the low diagnostic yield of tumor biopsies due to spatial heterogeneity. Herein, we characterized the epigenomic landscape of sRCC by profiling 107 epigenomic libraries from tissue and plasma samples from 50 patients with RCC and healthy volunteers. By profiling histone modifications and DNA methylation, we identified highly recurrent epigenomic reprogramming enriched in sRCC. Furthermore, CRISPRa experiments implicated the transcription factor FOSL1 in activating sRCC-associated gene regulatory programs, and FOSL1 expression was associated with the response to ICIs in RCC in two randomized clinical trials. Finally, we established a blood-based diagnostic approach using detectable sRCC epigenomic signatures in patient plasma, providing a framework for discovering epigenomic correlates of tumor histology via liquid biopsy.