ABSTRACT Poxviruses are a large group of DNA viruses with exclusively cytoplasmic life cycles and complex gene expression programs. A number of systems-level studies have analyzed bulk transcriptome and proteome changes upon poxvirus infection, but the cell-to-cell heterogeneity of the transcriptomic response, and the subcellular resolution of proteomic changes have remained unexplored. Here, we measured single-cell transcriptomes of Vaccinia virus-infected populations of HeLa cells and immortalized human fibroblasts, resolving the cell-to-cell heterogeneity of infection dynamics and host responses within those cell populations. We further integrated our transcriptomic data with changes in the levels and subcellular localization of the host and viral proteome throughout the course of Vaccinia virus infection. Our findings from single-cell RNA sequencing indicate conserved transcriptome changes independent of the cellular context, including widespread host shutoff, heightened expression of cellular transcripts implicated in stress responses, the rapid accumulation of viral transcripts, and the robust activation of antiviral pathways in bystander cells. While most host factors were co-regulated at the RNA and protein level, we identified a subset of factors where transcript and protein levels were discordant in infected cells; predominantly factors involved in transcriptional and post-transcriptional mRNA regulation. In addition, we detected the relocalization of several host proteins such as TENT4A, NLRC5, and TRIM5, to different cellular compartments in infected cells. Collectively, our comprehensive data provide spatial and temporal resolution of the cellular and viral transcriptomes and proteomes and offer a robust foundation for in-depth exploration of virus-host interactions in poxvirus-infected cells.

ABSTRACT Recombinant viruses expressing reporter genes allow visualization and quantification of viral infections and can be used as valid surrogates to identify the presence of the virus in infected cells and animal models. However, one of the limitations of recombinant viruses expressing reporter genes is the use of either fluorescent or luciferase proteins that are used alternatively for different purposes. Vaccinia virus (VV) is widely used as a viral vector, including recombinant (r)VV singly expressing either fluorescent or luciferase reporter genes that are useful for specific purposes. In this report, we engineered two novel rVV stably expressing both fluorescent (Scarlet or GFP) and luciferase (Nluc) reporter genes from different loci in the viral genome. In vitro , these bi-reporter expressing rVV have similar growth kinetics and plaque phenotype than those of the parental WR VV isolate. In vivo , rVV Nluc/Scarlet and rVV Nluc/GFP effectively infected mice and were easily detected using in vivo imaging systems (IVIS) and ex vivo in the lungs from infected mice. We used these bi-reporter expressing rVV to assess viral pathogenesis, infiltration of immune cells in the lungs, and to directly identify the different subsets of cells infected by VV in the absence of antibody staining. Collectively, these rVV expressing two reporter genes open the feasibility to study the biology of viral infections in vitro and in vivo , including host-pathogen interactions and dynamics or tropism of viral infections. Moreover, they represent an excellent approach for the discovery of new prophylactics and/or therapeutics for the treatment of poxvirus infections. IMPORTANCE Despite the eradication of variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, poxviruses still represent an important threat to human health due to their possible use as bioterrorism agents and the emergence of zoonotic poxvirus diseases. Recombinant vaccinia viruses (rVV) expressing easily traceable fluorescent or luciferase reporter genes have significantly contributed to the progress of poxvirus research. However, rVV expressing one marker gene have several constraints for in vitro and in vivo studies, since both fluorescent and luciferase proteins impose certain limitations for specific applications. To overcome these limitations, we generated optimized rVV stably expressing both fluorescent (Scarlet or GFP) and luciferase (Nluc) reporter genes to easily track viral infection in vitro and in vivo . This new generation of double reporter-expressing rVV represent an excellent option to study viral infection dynamics in cultured cells and validated animal models of infection, and for the discovery of new poxvirus antiviral treatments.

Chromosomal rearrangements, including translocations, are early and essential events in the formation of many tumors. Previous studies that defined the genetic requirements for rearrangement formation have identified differences between murine and human cells, most notably in the role of classical- and alternative-nonhomologous end joining factors (NHEJ). We reported that poly(ADP)ribose polymerase 3 (PARP3) promotes chromosomal rearrangements induced by endonucleases in multiple human cell types. In contrast to c-NHEJ factors, we show here that Parp3 also promotes rearrangements in murine cells, including translocations in murine embryonic stem cells (mESCs), class switch recombination in primary B cells and inversions in tail fibroblasts that generate Eml4-Alk fusions. In mESCs, Parp3-deficient cells had shorter deletion lengths at translocation junctions. This was corroborated using next-generation sequencing of Eml4-Alk junctions in tail fibroblasts and is consistent with a role for Parp3 in promoting the processing of DNA double-strand breaks. We confirmed a previous report that Parp1 also promotes rearrangement formation. In contrast with Parp3, rearrangement junctions in the absence of Parp1 had longer deletion lengths, suggesting Parp1 may suppress DSB processing. Together, these data indicate that Parp3 and Parp1 promote rearrangements with distinct phenotypes.

Monkeypox virus (MPXV) infection in humans are historically restricted to endemic regions in Africa. However, in 2022, an alarming number of MPXV cases have been reported globally with evidence of person-to-person transmission. Because of this, the World Health Organization (WHO) declared the MPXV outbreak a public health emergency of international concern. MPXV vaccines are limited and only two antivirals, tecovirimat and brincidofovir, approved by the United States (US) Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of smallpox, are currently available for the treatment of MPXV infection. Here, we evaluated 19 compounds previously shown to inhibit different RNA viruses for their ability to inhibit Orthopoxvirus infections. We first used recombinant vaccinia virus (rVACV) expressing fluorescence (Scarlet or GFP) and luciferase (Nluc) reporter genes to identify compounds with anti-Orthopoxvirus activity. Seven compounds from the ReFRAME library (antimycin A, mycophenolic acid, AVN- 944, pyrazofurin, mycophenolate mofetil, azaribine, and brequinar) and six compounds from the NPC library (buparvaquone, valinomycin, narasin, monensin, rotenone, and mubritinib) showed antiviral activity against rVACV. Notably, the anti-VACV activity of some of the compounds in the ReFRAME library (antimycin A, mycophenolic acid, AVN- 944, mycophenolate mofetil, and brequinar) and all the compounds from the NPC library (buparvaquone, valinomycin, narasin, monensin, rotenone, and mubritinib) were confirmed with MPXV, demonstrating the broad-spectrum antiviral activity against Orthopoxviruses and their potential to be used for the antiviral treatment of MPXV, or other Orthopoxvirus, infections.Despite the eradication of smallpox, some Orthopoxviruses remain important human pathogens, as exemplified by the recent 2022 monkeypox virus (MPXV) outbreak. Although smallpox vaccines are effective against MPXV, there is presently limited access to those vaccines. In addition, current antiviral treatment against MPXV infections is limited to the use of the FDA-approved drugs tecovirimat and brincidofovir. Thus, there is an urgent need to identify novel antivirals for the treatment of MPXV, and other potentially zoonotic Orthopoxvirus infections. Here, we show that thirteen compounds, derived from two different libraries, previously found to inhibit several RNA viruses, exhibit also antiviral activity against VACV. Notably, eleven compounds also displayed antiviral activity against MPXV, demonstrating their potential to be incorporated into the therapeutic armamentarium to combat Orthopoxvirus infections.

Abstract The zona pellucida (ZP) is vital for species-specific fertilization as this barrier mediates sperm-oocyte binding. Here, we determined whether sperm from distant mammalian orders (Carnivora, Primates, and Rodentia) could penetrate bovine oocytes by examining the role of bovine oviductal fluid and species-specific oviductal glycoprotein (OVGP1 or oviductin) from bovine, murine, or human sources in modulating the species specificity of bovine and murine oocytes. Sperm from all the species were found to penetrate intact bovine ovarian oocytes to form hybrid embryos. However, contact with oviductal fluid or bovine, murine, or human OVGP1, conferred the ZP species specificity, allowing only the penetration of the corresponding sperm regardless of the ZP’s origin. Glycolytic and microstructural analyses revealed that OVGP1 covers the pores present in the ZP and that OVGP1 glycosylation determines sperm specificity. This suggests specific fertilization capacity is acquired in the oviduct through the ZP’s incorporation of specific oviductin. Teaser The oocyte zona pellucida needs to interact with an oviduct protein called OVGP1 to ensure that only sperm from the same species can fertilize the egg. Abstract Figure Model

ABSTRACT Poxviruses have large DNA genomes and they are able to infect multiple vertebrate and invertebrate animals, including humans. Despite the eradication of smallpox, poxvirus infections still remain a significant public health concern. Vaccinia virus (VV) is the prototypic member in the poxviridae family and it has been used extensively for different therapeutic applications, including the generation of vaccines against multiple infectious diseases and/or for oncolytic treatment. Many attempts have been pursued to develop novel attenuated forms of VV with improved safety profiles for their implementation as vaccines and/or vaccines vectors. We and others have previously demonstrated how RNA viruses encoding codon-deoptimized viral genes are attenuated, immunogenic and able to protect, upon a single administration, against challenge with parental viruses. In this study, we employed the same experimental approach based on the use of misrepresented codons for the generation of a recombinant (r)VV encoding a codon-deoptimized A24R gene, which is a key component of the viral RNA polymerase. Similar to our previous studies with RNA viruses, the A24R codon-deoptimized rVV (v-A24cd) was highly attenuated in vivo but able to protect, after a single intranasal dose administration, against an otherwise lethal challenge with parental VV. These results indicate that poxviruses can be effectively attenuated by synonymous codon deoptimization and open the possibility of using this methodology alone or in combination with other experimental approaches for the development of attenuated vaccines for the treatment of poxvirus infection, or to generate improved VV-based vectors. Moreover, this approach could be applied to other DNA viruses. IMPORTANCE The family poxviridae includes multiple viruses of medical and veterinary relevance, being vaccinia virus (VV) the prototypic member in the family. VV was used during the smallpox vaccination campaign to eradicate variola virus (VARV), which is considered a credible bioterrorism threat. Because of novel innovations in genetic engineering and vaccine technology, VV has gained popularity as a viral vector for the development of vaccines against several infectious diseases. Several approaches have been used to generate attenuated VV for its implementation as vaccine and/or vaccine vector. Here, we generated a rVV containing a codon-deoptimized A24R gene (v-A24cd), which encodes a key component of the viral RNA polymerase. v-A24cd was stable in culture cells and highly attenuated in vivo but able to protect against a subsequent lethal challenge with parental VV. Our findings support the use of this approach for the development of safe, stable, and protective live-attenuated VV and/or vaccine vectors.

Abstract Genome-wide genetic screens are powerful tools to identify genes that act as host factors of viruses. We have applied this technique to the analyze the infection of HeLa cells by Vaccinia virus, in an attempt to find genes necessary for infection. Infection of cell populations harboring single gene inactivations resulted in no surviving cells, suggesting that no single gene knock-out was able to provide complete resistance to Vaccinia virus and thus allow cells to survive infection. In the absence of an absolute infection blockage, we explored if some gene inactivations could provide partial protection leading to a reduced probability of infection. Multiple experiments using modified screening procedures involving replication restricted viruses led to the identification of multiple genes whose inactivation potentially increase resistance to infection and therefore cell survival. As expected, significant gene hits were related to proteins known to act in virus entry, such as ITGB1 and AXL as well as genes belonging to their downstream related pathways. Additionally, we consistently found β 2 -microglobulin, encoded by the B2M gene, among the screening top hits, a novel finding that was further explored. Inactivation of B2M resulted in 54% and 91% reduced VV infection efficiency in HeLa and HAP1 cell lines respectively. In the absence of B2M, while virus binding to the cells was unaffected, virus internalization and early gene expression were significantly diminished. These results point to β 2 -microglobulin as a relevant factor in the Vaccinia virus entry process. Author summary Orthopoxviruses, a genus belonging to the family Poxviridae , include human pathogens like Variola virus, the causative agent of the now eradicated Smallpox, and Monkeypox virus that cause human outbreaks of zoonotic origin. Being the prototype Poxvirus, Vaccinia virus has been extensively used as the ideal model to study infection. For Poxviruses, both fluid phase endocytosis and direct fusion at the plasma membrane have been described as modes of entry. To date, only a few cellular factors have been identified in the vaccinia virus entry pathway. In this study, we report that blind genome-wide genetic screens allowed us to identify several cellular factors involved in Vaccinia Virus infection, of which many could be related to known factors in virus entry. In addition, we found that β 2 -microglobulin constitute a novel player for Poxvirus entry not related to previously described cellular pathways involved in the entry process. These findings add new information to the complex picture of Poxvirus entry and open the door to the discovery of new entry mechanisms used by Poxviruses.