Lupus nephritis is a potentially fatal autoimmune disease for which the current treatment is ineffective and often toxic. To develop mechanistic hypotheses of disease, we analyzed kidney samples from patients with lupus nephritis and from healthy control subjects using single-cell RNA sequencing. Our analysis revealed 21 subsets of leukocytes active in disease, including multiple populations of myeloid cells, T cells, natural killer cells and B cells that demonstrated both pro-inflammatory responses and inflammation-resolving responses. We found evidence of local activation of B cells correlated with an age-associated B-cell signature and evidence of progressive stages of monocyte differentiation within the kidney. A clear interferon response was observed in most cells. Two chemokine receptors, CXCR4 and CX3CR1, were broadly expressed, implying a potentially central role in cell trafficking. Gene expression of immune cells in urine and kidney was highly correlated, which would suggest that urine might serve as a surrogate for kidney biopsies. Much about the kidney-resident immune populations is a black box. Hacohen and colleagues use single cell RNA sequencing of kidney, skin and urine from lupus nephritis patients to describe the transcriptional state of the immune cells present in each compartment.

Lupus nephritis (LN) is a frequent manifestation of systemic lupus erythematosus, and fewer than half of patients achieve complete renal response with standard immunosuppressants. Identifying non-invasive, blood-based pathologic immune alterations associated with renal injury could aid therapeutic decisions. Here, we used mass cytometry immunophenotyping of peripheral blood mononuclear cells in 145 patients with biopsy-proven LN and 40 healthy controls to evaluate the heterogeneity of immune activation in patients with LN and to identify correlates of renal parameters and treatment response. Unbiased analysis identified 3 immunologically distinct groups of patients with LN that were associated with different patterns of histopathology, renal cell infiltrates, urine proteomic profiles, and treatment response at one year. Patients with enriched circulating granzyme B+ T cells at baseline showed more severe disease and increased numbers of activated CD8 T cells in the kidney, yet they had the highest likelihood of treatment response. A second group characterized primarily by a high type I interferon signature had a lower likelihood of response to therapy, while a third group appeared immunologically inactive by immunophenotyping at enrollment but with chronic renal injuries. Main immune profiles could be distilled down to 5 simple cytometric parameters that recapitulate several of the associations, highlighting the potential for blood immune profiling to translate to clinically useful non-invasive metrics to assess immune-mediated disease in LN.

 We present a detailed analysis of myeloid cell populations found in the kidneys of lupus nephritis (LN) patients, based on the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data collected as part of the Accelerating Medicines Partnership (AMP) in RA/SLE consortium. Overall, 23,819 cells isolated from 156 LN patients and 30 healthy donors passed QC. Clustering of these cells (figure 1A) identified populations of CD14 and CD16 monocytes, two subsets of tissue-resident macrophages and several types of dendritic cells (DCs). In addition, we found several transcriptionally-distinct subsets of differentiated macrophages, that were missing from healthy donors (figure 1B- C). The ratio between the frequency of these macrophage subsets and that of infiltrating monocytes positively correlated with the Activity Index (AI) (figure 1D). To infer the origins of the observed disease-specific macrophages, we compared them to several published scRNA-seq datasets of blood and kidney samples, and performed in addition trajectory analysis. Our results suggested that these subsets likely originate from both infiltrating monocytes and tissue-resident macrophages (figure 2A). Furthermore, our analysis indicated that the differentiation into disease-specific macrophages mostly takes place within the kidney. To identify putative extracellular signals driving the differentiation of infiltrating CD16 monocytes into disease-related activation states, we performed in vitro experiments in which CD16 monocytes were stimulated with a wide array of cytokines and molecules suggested to play role in SLE pathology, such as immune complexes (ICs) and various types of cellular debris. We measured transcriptional changes associated with each in vitro condition, and utilized the generated data to identify enriched signatures in the AMP scRNA-seq data, using gene set enrichment analysis (GSEA). This analysis suggested that apoptotic cells likely promote differentiation of CD16 monocytes into a phagocytic state (cluster 11; figure 2B). In contrast, ICs containing TLR7 ligands, as well as IFNγ, were found to be plausible drivers of differentiation into an activation state that was characterized by high production of several proinflammatory cytokines and chemokines ('high producers' – clusters 12 and 13; figure 2C-D). Of note, our analysis suggested that through chemokine production, these 'high producers' may play a central role in recruiting and retaining the phagocytic macrophage subsets. The frequency of a single population of disease-specific macrophages positively correlated with both the AI and the Chronicity Index (CI; figure 3A-B). This population (cluster 17) was characterized by the upregulation of a set of genes associated with lipid metabolism. While previous studies have reported the presence of a similar macrophage subset in other tissues, this has not yet been demonstrated in kidneys. Furthermore, our analysis identified subclusters within this population, associated with different specific pathways, that were separately correlated with the AI and CI. In particular, we found a proinflammatory signature in these cells that was negatively correlated with the AI and positively correlated with the CI (figure 3C-D). A systemic differential expression analysis showed that several myeloid subsets modulated their gene expression in a manner correlated with the AI, compared to healthy donors; a particular clear response was observed in CD16 monocytes (cluster 2), in both proliferative/mixed and pure membranous LN (figure 4A-B). GSEA suggested that these changes were driven, at least in part, by type I and type II IFN, IL-6 and TNFβ. A conjoint analysis of changes in subset frequencies and of the differentially expressed (DE) genes in these populations and in glomerular endothelial cells pointed to the concurrent upregulation of molecules that may promote fibrosis, and in particular fibronectin in CD16 monocytes and integrins capable of binding it in glomerular endothelial cells (figure 4D-F); furthermore, several of the phagocytic macrophages derived from CD16 monocytes upregulated a set of genes regulating the extracellular matrix (figure 4G). Of note, these observations were found in LN patients that had a 0 glomerular CI (defined as the sum of glomerular subscores of the CI), suggesting that these molecular events precede fibrosis and may promote it. An increase in glomerular CI was associated with significant changes in gene expression, in particular in cDC2 and pDCs (clusters 4 & 15), as well as 2 specific populations of phagocytic macrophages (clusters 14 and 15; figure 4C); these changes included a decrease in the interferon response. We verified the reproducibility of these signatures in an independent set of LN patients. Taken together, our results shed light on the mechanisms of kidney inflammation in LN, and provide a detailed view of the different subsets and activation states of myeloid cells found in LN kidneys and the putative relations between them, as well as the extracellular signals giving rise to these states.

Background

 The G1 and G2 risk variants (RVs) in Apolipoprotein L1 (APOL1) associate with chronic kidney disease (CKD) and may contribute to poorer outcomes for African American (AA) patients with lupus nephritis (LN). While the pathogenetic mechanism for APOL1 related CKD remains unknown, most studies focus on glomerular injury. This study leveraged the multi- center LN AMP to evaluate APOL1 RV associated clinical phenotypes and identify whether these genetic variants influence the transcriptomic landscape in kidney cells. 

Methods

 LN patients were consecutively enrolled in AMP at the time of a clinically indicated renal biopsy and followed for one year. Dissociated biopsies were passed through a droplet- based single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pipeline that included quality control of sequenced libraries. Genotypes for APOL1 RVs were identified by sanger sequencing for all AA patients enrolled with available DNA. 

Results

 In total, 104 AA patients were genotyped; 47 (45.2%) carried zero APOL1 RVs, 45 (43.3%) one RV, and 12 (11.5%) two RVs. RVs did not associate with baseline anti-dsDNA or complement levels, biopsy class/activity/chronicity, GFR or proteinuria (figure 1A-G). While there was a trend toward decreased GFR at one year by gene variant dosage, there was no association with changes in proteinuria (figure 1F-H). ScRNAseq yielded 88383 high quality cells in patients with zero RVs (n=30), 72288 one RV (n=28), and 28694 two RVs (n=11) spanning nine parenchymal cluster types (figure 2A). Independent of genotype, APOL1 expression was highest in podocyte, endothelial and ascending thin limb (ATL) cells (figure 2B). Median APOL1 expression was significantly higher in cells with one or two RVs in the ATL cluster but this association was not seen in podocytes or endothelial cells (figure 2C). Single cell pathway analysis revealed that the ATL cluster demonstrated greater pathway level variation between cells with two RVs vs zero than any other cluster, with the most distinguishing related to interferon signaling (increased), antigen presentation (increased), and mitochondrial function (decreased) (figure 2D). The ATL damage associated gene, lipocalin-2 (LCN2), was expressed at significantly higher levels in cells carrying two RVs (figure 2E). Likewise, the proportion of ATL cells double positive for APOL1 and LCN2 was higher in patients with two RVs (figure 2F). While it did not reach significance, the percentage of ATL cells expressing APOL1 more strongly correlated with eGFR and tubular atrophy on biopsy histology among patients with two RVs compared to those carrying zero or one RV (figure 3A-F). 

Conclusions

 APOL1 RVs associated with decreased GFR but not proteinuria suggesting that current clinical indicators of LN severity may not appropriately prognosticate patients carrying APOL1 RVs and that the use of routine genotyping in the clinical setting may better risk stratify AA patients with LN. The scRNAseq data revealed that ATL cells likely express APOL1 and that this may be relevant to progressive kidney dysfunction over time. This highlights the potential for a previously unrecognized extraglomerular injury in AA SLE patients carrying APOL1 RVs providing a novel future direction for understanding APOL1 toxicity and translation to clinical trials.

Background

 Lupus nephritis (LN) is a common and severe complication of systemic lupus erythematosus requiring renal biopsy to guide treatment decisions. Despite standard-of-care therapy, a third of patients with LN class III, IV, or V show a progressive decline in kidney function. Identifying distinct inflammatory processes associated with LN using non-invasive tools may improve treatment targeting. 

Method

 We applied mass cytometry using four 48-marker panels to characterize peripheral blood mononuclear cells from 140 patients with active, biopsy-proven proliferative (class III or IV +/- V, n=98) or membranous (class V, n=42) nephritis and 40 healthy controls in the Accelerated Medicine Partnership RA/SLE Network Phase II study. Renal response was determined at 1 year (n=107), and longitudinal samples were collected (n=49). 

Results

 By applying covarying neighborhood analysis, we observed a marked enrichment of cell neighborhoods that expressed type I interferon (IFN-I)-induced proteins, including MX1 (figure 1A) and Siglec1, reflecting a simple cytometric detection of an IFN-I signature. Specific immunophenotypic alterations, including activated and proliferating cells (Ki67hi) across immune cell types, such as plasmablasts (B8) and Tph (T11), were associated with IFN-I signaling (figure 1B). Amongst cells strongly associated with IFN-I, we identified a naive-like (CD45RA+CCR7+) CD4 T cell cluster (T12) expressing low levels of TCF1, suggesting early activation (figure 1C). We confirmed that IFN-I had an additive effect with TCR stimulation in decreasing TCF1 (TCF7 gene) expression in naive T cells using a recently published bulk RNAseq dataset1 (figure 2). Longitudinally, the cell subsets strongly associated with IFN-I, including T12, did not change in abundance over time independently from the renal outcome (longitudinal mixed effect model in complete responders p = 0.37, non-responder p = 0.62). As IFN-I signaling and the frequency of cell subsets varied across individuals, we stratified all samples using an unsupervised analysis based on 55 immune cell subsets. We identified 3 LN patient subgroups: the first group (G0) included all controls and 20% baseline LN patients; the two others (G1, G2) included only LN patients (46 patients each). G2 was associated with an increased proportion of GZMB+ T cells which were not correlated with IFN-I score (figure 1C). G1 displayed the highest cytometric IFN- I scores and was driven mainly by cells enriched with IFN-I-induced proteins, including T12 (figure 3A). Additionally, IFN-I cytometric score was strongly correlated with an IFN-I score in kidney leukocytes from paired samples (rho = 0.73, p < 0.001). Finally, after adjusting for a history of previous biopsy and immunosuppression at baseline, group G1 was significantly associated with non-response at 1 year (figure 3B). 

Conclusion

 IFN-I signaling in LN patients is associated with persistent enrichment of altered and activated immune cells, despite immunosuppression. Patients with increased IFN-I signaling in the peripheral blood have increased IFN-I signaling in the kidney and represent a group with poor response to standard-of-care. 

Reference

 Sumida T, et al. Type I interferon transcriptional network regulates expression of coinhibitory receptors in human T cells, Nature Immunology. 2022;23(4):632–42.

Lupus nephritis is a potentially fatal autoimmune disease, whose current treatment is ineffective and often toxic. To gain insights into disease mechanisms, we analyzed kidney samples from lupus nephritis patients and healthy controls using single-cell RNA-seq. Our analysis revealed 21 subsets of leukocytes active in disease, including multiple populations of myeloid, T, NK and B cells, demonstrating both pro-inflammatory and resolving responses. We found evidence of local activation of B cells correlated with an age-associated B cell signature, and of progressive stages of monocyte differentiation within the kidney. A clear interferon response was observed in most cells. Two chemokine receptors, CXCR4 and CX3CR1, were broadly expressed, pointing to potential therapeutic targets. Gene expression of immune cells in urine and kidney was highly correlated, suggesting urine may be a surrogate for kidney biopsies. Our results provide a first comprehensive view of the complex network of leukocytes active in lupus nephritis kidneys.