Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that inhibits bacterial fatty acid synthesis at the enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) step. Resistance to triclosan inEscherichia coli is acquired through a missense mutation in the fabI gene that leads to the expression of FabI[G93V]. The specific activity and substrate affinities of FabI[G93V] are similar to FabI. Two different binding assays establish that triclosan dramatically increases the affinity of FabI for NAD+. In contrast, triclosan does not increase the binding of NAD+to FabI[G93V]. The x-ray crystal structure of the FabI-NAD+-triclosan complex confirms that hydrogen bonds and hydrophobic interactions between triclosan and both the protein and the NAD+ cofactor contribute to the formation of a stable ternary complex, with the drug binding at the enoyl substrate site. These data show that the formation of a noncovalent “bi-substrate” complex accounts for the effectiveness of triclosan as a FabI inhibitor and illustrates that mutations in the FabI active site that interfere with the formation of a stable FabI-NAD+-triclosan ternary complex acquire resistance to the drug. Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that inhibits bacterial fatty acid synthesis at the enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) step. Resistance to triclosan inEscherichia coli is acquired through a missense mutation in the fabI gene that leads to the expression of FabI[G93V]. The specific activity and substrate affinities of FabI[G93V] are similar to FabI. Two different binding assays establish that triclosan dramatically increases the affinity of FabI for NAD+. In contrast, triclosan does not increase the binding of NAD+to FabI[G93V]. The x-ray crystal structure of the FabI-NAD+-triclosan complex confirms that hydrogen bonds and hydrophobic interactions between triclosan and both the protein and the NAD+ cofactor contribute to the formation of a stable ternary complex, with the drug binding at the enoyl substrate site. These data show that the formation of a noncovalent “bi-substrate” complex accounts for the effectiveness of triclosan as a FabI inhibitor and illustrates that mutations in the FabI active site that interfere with the formation of a stable FabI-NAD+-triclosan ternary complex acquire resistance to the drug. The fatty acid synthase system of Escherichia coli is the paradigm for the type II or dissociated fatty acid synthase systems (for reviews, see Refs. 1Rock C.O. Jackowski S. Cronan Jr., J.E. Vance D.E. Vance J.E. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins, and Membranes. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam1996: 35-74Google Scholar, 2Rock C.O. Cronan Jr., J.E. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1302: 1-16Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar, 3Cronan Jr., J.E. Rock C.O. Neidhardt F.C. Curtis R. Gross C.A. Ingraham J.L. Lin E.C.C. Low K.B. Magasanik B. Reznikoff W. Riley M. Schaechter M. Umbarger H.E. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1996: 612-636Google Scholar). Distinct genes encode each of the individual enzymes, and the same basic chemical reaction is often catalyzed by multiple isozymes. There are four basic reactions that constitute a single round of elongation. The first step is the condensation of malonyl-ACP 1The abbreviations used are: ACP, acyl carrier protein; FabI, enoyl-acyl carrier protein reductase; triclosan, 2,4,4′-trichloro-2′-hydroxydiphenyl ether; IC50, concentration giving 50% inhibition of activity; 4:1-NAC, crotonyl-N-acetylcysteamine; 8:1-NAC, trans-2-octadecenoyl-N-acetylcysteamine. with either acetyl-CoA to initiate fatty acid synthesis (FabH) or with the growing acyl chain to continue cycles of elongation (FabB or FabF). The β-ketoacyl-ACP is reduced by an NADPH-dependent β-ketoacyl-ACP reductase (FabG). Only a single enzyme is responsible for this step (4Zhang Y. Cronan Jr., J.E. J. Bacteriol. 1998; 180: 3295-3303Crossref PubMed Google Scholar). There are two β-hydroxyacyl-ACP dehydrases (FabA and FabZ) capable of forming trans-2-enoyl-ACP. The product of the fabA gene is specifically involved in the introduction of a cis double bond into the growing acyl chain at the β-hydroxydecanoyl-ACP step and most efficiently catalyzes dehydration of short-chain β-hydroxyacyl-ACPs, whereas the FabZ dehydratase has a broader substrate specificity (5Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 27795-27801Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar). The last reaction in each elongation cycle is catalyzed by enoyl-ACP reductase (FabI). Contrary to the initial conclusion that there were two enoyl-ACP reductases, based on assays in crude extracts (6Weeks G. Wakil S.J. J. Biol. Chem. 1968; 243: 1180-1189Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), E. coli cells possess only a single NADH-dependent enoyl-ACP reductases encoded by the fabI gene that utilizes all chain lengths (7Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26538-26542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar). The importance of fatty acid biosynthesis to cell growth and function makes this pathway an attractive target for the development of antibacterial agents. Two important control points in the cycle are the condensing enzymes and the enoyl-ACP reductase (8Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 1833-1836Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (196) Google Scholar, 9Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10996-11000Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar), and both reactions are targeted by compounds that effectively inhibit fatty acid synthesis. Two natural products, cerulenin and thiolactomycin, are potent antibiotics that function by specifically inhibiting the condensing enzyme reactions (for reviews, see Refs. 3Cronan Jr., J.E. Rock C.O. Neidhardt F.C. Curtis R. Gross C.A. Ingraham J.L. Lin E.C.C. Low K.B. Magasanik B. Reznikoff W. Riley M. Schaechter M. Umbarger H.E. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology, Washington, D. C.1996: 612-636Google Scholar, 10Jackowski S. Sutcliffe J.A. Georgopapadakou N.H. Emerging Targets for Antibacterial and Antifungal Chemotherapy. Chapman and Hall, New York1991: 151-162Google Scholar). The diazaborines, a class of heterocyclic antibacterials, inhibit fatty acid biosynthesis by blocking the FabI step (11Bergler H. Wallner P. Ebeling A. Leitinger B. Fuchsbichler S. Aschauer H. Kollenz G. Högenauer G. Turnowsky F. J. Biol. Chem. 1994; 269: 5493-5496Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Resistance to the diazaborines arises from a missense mutation in the fabIgene that leads to the expression of a FabI[G93S] mutant protein (12Turnowsky F. Fuchs K. Jeschek C. Högenauer G. J. Bacteriol. 1989; 171: 6555-6565Crossref PubMed Google Scholar,13Bergler H. Högenauer G. Turnowsky F. J. Gen. Microbiol. 1992; 138: 2093-2100Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). Similarly, the fabI analog in Mycobacterium tuberculosis, the inhA gene, encodes a cellular target for isoniazid and ethionamide. A point mutation in the inhAgene confers resistance to the drugs (14Banerjee A. Dubnau E. Quémard A. Balasubramanian V. Um K.S. Wilson T. Collins D. de Lisle G. Jacobs Jr., W.R. Science. 1994; 263: 227-230Crossref PubMed Scopus (1236) Google Scholar). Both isoniazid and diazaborine bind at the substrate site of the respective enoyl-ACP reductases and covalently react with NAD+ to form tight binding bi-substrate complexes (15Baldock C. Rafferty J.B. Sedeinikova S.E. Baker P.J. Stuitje A.R. Slabas A.R. Hawkes T.R. Rice D.W. Science. 1996; 274: 2107-2110Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar, 16Rozwarski D. Grant G. Barton D. Jacobs W. Sacchettini J.C. Science. 1998; 279: 98-102Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar). Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that enjoys widespread applications in a multitude of contemporary consumer products including, soaps, detergents, toothpastes, skin care products, cutting boards, and mattress pads (17Bhargava H.N. Leonard P.A. Am. J. Infect. Control. 1996; 24: 209-218Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (441) Google Scholar). Triclosan is widely thought to be a nonspecific biocide that attacks bacterial membranes (18Regös J. Zak O. Solf R. Vischer W.A. Weirich E.G. Dermatologica (Basel). 1979; 158: 72-79Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 19Vischer W.A. Regös J. Zentbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1974; 226: 376-389PubMed Google Scholar, 20Regös J. Hitz H.R. Zentbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1974; 226: 390-401PubMed Google Scholar), and if triclosan does not have a discrete mechanism of action, the acquisition of cellular resistance is unlikely. However, recent work reveals that resistant E. coli strains arise from missense mutations in the fabIgene (21McMurray L.M. Oethinger M. Levy S. Nature. 1998; 394: 531-532Crossref PubMed Scopus (838) Google Scholar, 22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) and that triclosan and other 2-hydroxydiphenyl ethers directly inhibit fatty acid biosynthesis in vivo and FabI catalysis in vitro (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar). The goal of this study was to investigate the mechanism by which triclosan inhibits FabI. Sources of supplies were: American Radiochemicals, Inc., [adenine-2,8-3H]NAD (specific activity 25 Ci/mmol); Sigma, NADH and NAD+; and Millipore Corp., Ultrafree Probind centrifugal filtration units. The substrate analogs, 4:1-NAC and 8:1-NAC, were the generous gift of Rocco Gogliotti and John Domagala (Parke-Davis). Triclosan was the gift of KIC Chemicals, Inc. (Armonk, NY). All other chemicals were of the best grade available. The expression and purification of His-tag FabI was described previously (7Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26538-26542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar). ThefabI G93V allele was amplified from the chromosome of the triclosan-resistant strain RJH108 (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) and ligated into the pET15b expression vector. DNA sequencing of the expression construct confirmed the presence of the single point mutation. The His-tagged FabI[G93V] was then expressed and purified to homogeneity by Ni2+ affinity chromatography using the same methods as described for the wild-type FabI (7Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26538-26542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar). Protein was determined by the method of Bradford (23Bradford M.M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (217544) Google Scholar). FabI activity was assayed spectrophotometrically by monitoring the decrease in absorption at 340 nm using an adaptation of the spectrophotometric assay used by Bergleret al. (24Bergler H. Fuchsbichler S. Högenauer G. Turnowsky F. Eur. J. Biochem. 1996; 242: 689-694Crossref PubMed Scopus (133) Google Scholar). Standard reactions contained 100 μm 8:1-NAC, 12 μg of homogeneous FabI (7Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26538-26542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 8Heath R.J. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1996; 271: 1833-1836Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (196) Google Scholar), 200 μm NADH, 0.1 m sodium phosphate, pH 7.5, in a final volume of 300 μl. The reactions were performed at 24 °C in semimicro quartz cuvettes. The change in optical density was continuously monitored for 1 min, and the reaction rate was calculated from the slope of the trace. Triclosan was added to the final concentrations indicated in the figure legend from serially diluted stock solutions in Me2SO. The Me2SO concentration in all assays was maintained at 1.66%, which did not significantly affect FabI activity. The FabI specific activity in the absence of drugs under these experimental conditions was 0.36 μmol/min/mg. Data points were the mean of duplicate assays, and the individual values were within ± 5% of the average. Two methods were used to measure the binding of NAD+ to FabI in the presence and absence of triclosan. The first method employed gel filtration chromatography to separate [3H]NAD+ bound to FabI from free [3H]NAD+. A 0.7 × 8-cm column (3 ml) of Sephadex G-25 was equilibrated in 0.1 m sodium phosphate, pH 7.5, at 24 °C. Samples (50 μl) were applied, the column eluted with the same buffer at a flow rate of approximately 0.25 ml/min, and 5-drop (110 μl) fractions were collected. The second method used binding of FabI to a polyvinylidene difluoride membrane to separate free from FabI-bound [3H]NAD+. Assays were placed into a Ultrafree-Probind centrifugal filtration unit containing a 0.2-cm (2Rock C.O. Cronan Jr., J.E. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1302: 1-16Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar), 0.45-μm polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Corp.). The filters were washed once with 100 μl of 0.1 msodium phosphate and counted in 5 ml of ScintSafe scintillation solution. Both assays contained 0.1 m sodium phosphate, 1 μm [3H]NAD+ (specific activity 4 Ci/mmol), 2% Me2SO, the indicated concentrations of triclosan, and 7.6 μg of FabI or FabI[G93V] in a final volume of 50 μl. Samples were incubated at 24 °C for 15 min and then separated using one of the two methods outlined above. Crystals of FabI were grown from hanging drops (6 μl) containing 5 mg/ml FabI, 25 mm Tris, 150 mm NaCl, 0.5 mm dithiothreitol, 5 mg/ml NADH, 50 mm sodium acetate, 4% polyethylene glycol 4000 (w/v), pH 4.6. The drops were equilibrated against a reservoir (600 μl) containing 100 mm sodium acetate, pH 4.6, and 8% polyethylene glycol 4000 (w/v). Large hexagonal bipyrimidal crystals appeared after equilibration for 1 day at 26 °C and reached dimensions of 1.0 × 0.5 × 0.5 mm. Crystals of the FabI-NAD+-triclosan ternary complex were prepared by soaking pregrown crystals of FabI in solutions containing 10 mg/ml NAD+, 10 mg/ml triclosan, 100 mmsodium acetate, pH 4.6, and 10% polyethylene glycol 4000 (w/v) for 7 days. X-ray diffraction data were collected on the IMCA beamline (17-ID) at the Advanced Photon Source at the Argonne National Laboratory. The crystals used for data collection were first transferred to a cryoprotectant buffer containing 100 mmsodium acetate, pH 4.6, 10% polyethylene glycol 4000 (w/v), 25% glycerol (v/v) for 1 h and then flash-frozen in a stream of liquid nitrogen. X-ray data to 1.8-Å resolution were collected at 100 K using synchrotron X-radiation at a 1.0-Å wavelength and a Bruker 2 × 2 mosaic CCD x-ray detector. The x-ray data were then processed using the SAINT (Bruker x-ray, Madison, WI) program package. Crystals of the FabI-NAD+-triclosan complex were hexagonal, space group P6122 (number 178) with unit cell dimensionsa = b = 79.70 and c = 327.7 Å and two molecules of the ternary complex in the asymmetric unit. These crystals were isomorphous to those of the FabI-NAD+-diazaborine complex reported by Baldock et al. (15Baldock C. Rafferty J.B. Sedeinikova S.E. Baker P.J. Stuitje A.R. Slabas A.R. Hawkes T.R. Rice D.W. Science. 1996; 274: 2107-2110Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar). The FabI structure was initially refined as a rigid body using XPLOR, and the positions and conformation of the bound NAD+ and triclosan molecules were determined from Fo-Fc difference electron density maps. In addition, the positions of the 185 tightly bound water molecules were determined from subsequent residual electron density maps. The entire structure containing 2 molecules of the FabI-NAD+-triclosan complex and 185 water molecules was refined to a crystallographic R-factor of 0.232 using data from 8.0 to 1.8 Å resolution. Residues 194–210 were disordered in the structure. Solvent-accessible surface areas were calculated using a 1.4-Å probe with the SOLVATION module of the InsightII software (version 97.1, Molecular Simulations, Inc.). Previous work showed that FabI was inhibited by triclosan (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) and that a mutation in the fabI gene that results in the expression of a FabI[G93V] protein exhibited high level triclosan resistance (21McMurray L.M. Oethinger M. Levy S. Nature. 1998; 394: 531-532Crossref PubMed Scopus (838) Google Scholar, 22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar). FabI[G93V] was cloned into the pET15b expression vector and expressed and purified as described under “Experimental Procedures.” The apparent K mvalues for the two substrates were determined for both the wild-type and mutant protein. The wild-type protein had an apparentK m for NADH of 15 ± 1 μm, whereas the FabI[G93V] exhibited an apparent K mfor NADH of 8 ± 2 μm. Thus, there were not major differences between the kinetic constants for NADH in the wild-type and mutant protein. We also measured the apparent K m for the enoyl substrate using 4:1-NAC. This substrate analog was selected for these experiments because it had the higher solubility in the assay buffer than 8:1-NAC. The apparent K m for 4:1-NAC was 25 ± 5 mm for FabI compared with 15 ± 2.2 mm for FabI[G93V]. The V max for FabI was 4.4 μmol/min/mg, and for FabI[G93V], theV max was 3.6 μmol/min/mg. These data illustrated that FabI and FabI[G93V] had similar specific activities and substrate and cofactor binding characteristics. The observation that cells expressing the FabI[G93V] protein have a minimum inhibitory concentration for triclosan that was 64-fold higher than the wild-type strain (0.5 compared with 32 μg/ml) (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) suggested that the FabI[G93V] protein would be refractory to triclosan inhibitionin vitro. We directly tested this assumption using the spectrophotometric FabI assay and found that both FabI and FabI[G93V] were inhibited by triclosan (Fig. 1). The IC50 for FabI (2 μm) was lower than the IC50 for FabI[G93V] (10 μm). This ≈5-fold increase in the IC50 for FabI[G93V] was consistent with increased resistance of the enzyme to triclosan inhibition; however, the magnitude of this difference was significantly less than was predicted from the 64-fold difference in the effectiveness of triclosan against the mutant strain. This unexpected discrepancy between the minimum inhibitory concentration and IC50 data led us to examine the mechanism of FabI inhibition by triclosan in more detail. The data in Fig. 1 was obtained by starting the assay with the addition of FabI and measuring the initial rate of NADH oxidation from the linear portion of the trace within the first 1 min of the reaction. Examination of the time course of the reaction over a longer period of time (15 min) revealed a clear difference between the inhibition of FabI and FabI[G93V] by triclosan (Fig. 2). Although there was an initial burst of activity in the presence of triclosan, within 3 min of the start of the experiment, FabI catalysis essentially ceased (Fig.2 A). Thus, the inhibition of FabI by triclosan became irreversible as a function of time. In contrast, triclosan inhibition of FabI[G93V] was consistent throughout the 15-min time course, yielding a slower rate and no indication of increasing inhibition as a function of time (Fig. 2 B). These data suggested that the difference between the effectiveness of triclosan against wild-type strains compared with strain RJH108 (fabI G93V) was the ability of triclosan to irreversibly inhibit FabI, but not FabI[G93V], as a function of time. The data in Figs. 1 and 2 suggested that the irreversible inhibition of FabI by triclosan arose from the tight binding of the drug to the enzyme in conjunction with another component in the assay. This prediction was experimentally tested by measuring the association of [3H]NAD+ with either FabI or FabI[G93V] in the presence of triclosan by gel filtration chromatography (Fig.3). FabI bound approximately 80% of the [3H]NAD+ (0.2 mol/mol of FabI subunit) when triclosan was present, as evidenced from the shift in radioactivity from the included volume (fractions 18–40) to the excluded volume (fractions 11–17) of the column. In contrast, FabI[G93V] did not displace [3H]NAD+ from the included to the void volume of the column. The column was not equilibrated with triclosan; thus the appearance of label associated with FabI in the excluded volume indicated a stable association with the enzyme during the course of the separation (about 30 min). The binding of [3H]NAD+ to the two enzymes in the absence of triclosan was barely detectable and equivalent to the binding of [3H]NAD+ to FabI[G93V] in the presence of triclosan shown in Fig. 3 (not shown, see below). These data demonstrated that triclosan induced the high affinity binding of NAD+ to FabI but not to FabI[G93V]. This concept was experimentally verified using a filter binding assay developed to quantitate the binding of [3H]NAD+ to FabI in the presence and absence of triclosan. FabI exhibited saturable NAD+ binding in the presence of 4 μm triclosan (Fig.4 A). An apparent association constant (K) of 2.5 μm–1 for NAD+ in the presence of triclosan was calculated by analysis of the data using a double-reciprocal plot (Fig.4 B). There was no indication of cooperative binding or the existence of more than a single class of sites by analysis of the data using a Scatchard plot (not shown). In contrast, we detected virtually no binding of [3H]NAD+ to FabI in the absence of triclosan (Fig. 4 A). The affinity of FabI for NAD+ was so low that we measured only trace levels of [3H]NAD+ binding to the free enzyme by this technique. Therefore, we examined the effectiveness of NAD+as a product inhibitor of FabI using the spectrophototmetric assay. NAD+ was a poor inhibitor of the FabI reaction, with 50% inhibition occurring between 10 and 20 mm NAD+. These data indicated a very low apparent affinity of FabI for NAD+ in the 10–50 mm range (not shown). The filter binding assay was next used to examine the effect of triclosan concentration on NAD+ binding to FabI (Fig.5). The association of [3H]NAD+ with FabI was dependent on the concentration of triclosan and saturable (Fig. 5 A). The apparent K for triclosan binding was calculated as 4.2 μm–1 (Fig. 5 B). Thus, in the presence of triclosan, the affinity of FabI for NAD+increased by approximately 4 orders of magnitude (>10 mmto 2.5 μm–1).Figure 5Triclosan-dependent [3H]NAD+;1 binding to FabI. Panel A, dependence of [3H]NAD+binding to FabI on the concentration of triclosan. Panel B,double-reciprocal plot of the data in panel A. The apparent triclosan association constant (K) was 4.2 μm. The filter binding assay was performed as described under “Experimental Procedures.”View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) The binding studies suggested that the basis for the potency of triclosan as a FabI inhibitor was because of the formation of a high affinity FabI-NAD+-triclosan ternary complex. Determining the structure of the FabI-NAD+-triclosan ternary complex by x-ray crystallography directly tested this idea (see “Experimental Procedures”). Triclosan bound noncovalently in a location adjacent to the nicotinamide portion of NAD+ (Fig.6 A). There was 494.7 Å2 of surface area buried between triclosan and the protein and 238.5 Å2 of surface area buried at the interface with NAD+. The diphenyl ether of triclosan adopted a conformation with a dihedral angle of about 90° between the two phenyl rings of the inhibitor. The 2-hydoxy-3-chlorophenyl ring formed a parallel stack with the nicotinamide ring of the co-factor with an interplanar stacking distance of 3.4 Å. In addition to the nicotinamide ring, the hydroxychlorophenyl ring was surrounded by hydrophobic side chains on the protein including Tyr-146 and Tyr-156. The 2′-hydroxyl group of triclosan was involved in two strong hydrogen bonds. One bond was with the 2′-hydroxyl group of the nicotinamide ribose, and the second was to the phenolic hydroxyl group of Tyr-156. The 2,4-dichlorophenyl ring of triclosan was rotated 90° of the plane of the hydroxychlorophenyl group. The chlorine substituent in the 4-position of the phenyl ring accepted a hydrogen bond from the backbone amide of Ala-95 and formed hydrophobic contacts with the side chain of Met-159. These data supported the concept that the formation of a stable, ternary FabI-NAD+-triclosan complex accounted for the effective inhibition of the FabI reaction by this drug. The formation of a ternary FabI-NAD+-triclosan complex accounts for the effectiveness of triclosan as an antibacterial agent. Triclosan binds to the enoyl substrate site on FabI, and tight binding of the drug requires interactions between both the protein and the NAD+ cofactor (Fig. 6 A). There is a strong similarity between the mode of triclosan NAD+ binding to FabI (Fig. 6 A) and the structure of the FabI-NAD+-diazaborine complex described by Baldock et al. (15Baldock C. Rafferty J.B. Sedeinikova S.E. Baker P.J. Stuitje A.R. Slabas A.R. Hawkes T.R. Rice D.W. Science. 1996; 274: 2107-2110Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar) (Fig. 6 B). The diazaborine compounds form covalent adducts with NAD+ at the FabI active site. The boron atom of the diazaborine is attached to the 2′-hydroxyl of the NAD+ ribose, and this is the same 2′-hydroxyl group that forms a hydrogen bond with the hydroxychlorophenyl hydroxyl of triclosan. The FabI-NAD+-triclosan ternary complexes can be superimposed with the diazaborine complex with a root mean square deviation of 0.3 Å for the observed α-carbons. Residues 194–210 were not well defined in the electron density map of the FabI-NAD+-triclosan complex. These residues are also not observed in the native structure of FabI, but the positions of these residues are evident in the FabI-NAD+-diazaborine structure (15Baldock C. Rafferty J.B. Sedeinikova S.E. Baker P.J. Stuitje A.R. Slabas A.R. Hawkes T.R. Rice D.W. Science. 1996; 274: 2107-2110Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar). If the loop seen in the FabI-NAD+-diazaborine complex is modeled onto the triclosan complex structure, there are no conflicting contacts between triclosan and the protein. In this model Ile-200 is in van der Waals contact with the 2,4-dichlorophenyl ring of triclosan, and Phe-203 is in contact with the hydroxychlorophenyl group. These data support the conclusion that triclosan forms a ternary complex that acts as a dead-end inhibitor that effectively removes protein from the catalytic cycle. These results lead to the general conclusion that all 2-hydroxydiphenyl ether FabI inhibitors (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) block enzyme activity through the formation of noncovalent bisubstrate complexes with NAD+. Missense mutations, like FabI[G93V], confer resistance by preventing the formation of the FabI-NAD+-triclosan ternary complex. Strains expressing either FabI[G93S] and FabI[G93V] have significantly elevated minimum inhibitory concentrations for triclosan (21McMurray L.M. Oethinger M. Levy S. Nature. 1998; 394: 531-532Crossref PubMed Scopus (838) Google Scholar, 22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar). Although FabI[G93V] activity is still inhibited at high triclosan concentrations (Fig. 2 B), the drug is not capable of forming a stable complex with the reductase. Triclosan is neither a dead-end inhibitor of FabI[G93V] (Fig. 2) nor does it form a FabI[G93V]-NAD+-triclosan ternary complex based on the inability of FabI[G93V] to bind [3H]NAD+(Fig. 3). These biochemical results are interpreted by modeling the Val-93 into the Gly-93 position in the structure of the triclosan complex. Gly-93 lies on one side of the substrate binding pocket, and the branched hydrophobic side chain of Val protrudes into the pocket and occupies the same space as the dichlorophenyl ring of triclosan (see Fig. 6). Therefore, we conclude that the substitution of Gly-93 with bulkier amino acid residues imparts resistance to 2-hydroxydiphenyl ethers because of steric interference. Our identification of a ternary FabI-NAD+-triclosan complex reinforces the conclusion that FabI is a specific intracellular target for triclosan. Triclosan permeabilizes the bacterial envelope (18Regös J. Zak O. Solf R. Vischer W.A. Weirich E.G. Dermatologica (Basel). 1979; 158: 72-79Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 19Vischer W.A. Regös J. Zentbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1974; 226: 376-389PubMed Google Scholar, 20Regös J. Hitz H.R. Zentbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1974; 226: 390-401PubMed Google Scholar), and these findings have justified the widespread and increasing use of triclosan in consumer personal care products based on the reasoning that bacteria would not acquire resistance to a nonspecific membrane disrupter. However, this type of evidence is not sufficient to conclude that a compound has nonspecific membrane effects, because agents that block fatty acid biosynthesis perturb membrane assembly by stopping phospholipid production. For example, the temperature-sensitivefabI mutant was initially designated envM because it was isolated through a genetic selection for strains with envelope-permeability defects (25Egan A.F. Russell R.R.B. Genet. Res. 1973; 21: 3603-3611Crossref Scopus (30) Google Scholar). Also, the diazaborine class of FabI inhibitors are known to perturb membrane function as well (12Turnowsky F. Fuchs K. Jeschek C. Högenauer G. J. Bacteriol. 1989; 171: 6555-6565Crossref PubMed Google Scholar). The first evidence that triclosan has a specific cellular target was provided by McMurray et al. (21McMurray L.M. Oethinger M. Levy S. Nature. 1998; 394: 531-532Crossref PubMed Scopus (838) Google Scholar) who found that triclosan-resistant strains have missense mutations in thefabI gene. The biochemical analysis of FabI inhibition by triclosan (22Heath R.J. Yu Y.-T. Shapiro M.A. Olson E. Rock C.O. J. Biol. Chem. 1998; 273: 30316-30320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (323) Google Scholar) and the delineation of its mechanism of binding (this study) provide definitive evidence that enoyl-ACP reductase is the primary site for triclosan action. Thus, the reported effects of triclosan on membrane structure and function are a consequence of its specific inhibition of fatty acid biosynthesis at the FabI step. The ability of E. coli to acquire genetic resistance to triclosan and related compounds through missense mutations in thefabI gene suggests that the widespread use of this drug will lead to the appearance of resistant organisms that will compromise the usefulness of triclosan. The ubiquitous occurrence of type II fatty acid synthase systems in bacteria and the essential nature of the FabI reaction make this enzyme an attractive target for antibacterial drugs. Accordingly, triclosan is effective against a broad spectrum of bacteria (17Bhargava H.N. Leonard P.A. Am. J. Infect. Control. 1996; 24: 209-218Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (441) Google Scholar), including multi-drug-resistant Staphylococcus aureus (26Bartzokas C.A. Paton J.H. Gibson M.F. Graham F. McLoughlin G.A. Croton R.S. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 1422-1425Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 27Webster J. J. Hosp. Infect. 1992; 21: 137-141Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (43) Google Scholar). The design and development of second generation FabI inhibitors based on their ability to form ternary FabI-NAD+-drug complexes will supplement the arsenal against a broad spectrum of bacteria. We thank Amy Sullivan and Magdalena Kaminska for technical assistance, Rocco Gogliotti and John Domagala for the trans-2-acyl-NAC substrate analogs, Tom Mueller and Craig Banotai for the protein used in the crystal structure studies, Steve VanderRoestand for the fabI clone, and our colleagues for their help in editing the manuscript.

Abstract Histone acetyltransferases (HAT) catalyze the acylation of lysine side chains and are implicated in diverse human cancers as both oncogenes and non-oncogene dependencies 1 . Acetyl-CoA-competitive HAT inhibitors have garnered attention as potential cancer therapeutics and the first clinical trial for this class is ongoing ( NCT04606446 ). Despite broad enthusiasm for these targets, notably including CBP/p300 and KAT6A/B 2–5 , the potential mechanisms of therapeutic response and evolved drug resistance remain poorly understood. Using comparative transcriptional genomics, we found that the direct gene regulatory consequences of CBP/p300 HAT inhibition are indistinguishable in models of intrinsically hypersensitive and insensitive acute myeloid leukemia (AML). We therefore modelled acquired drug resistance using a forward genetic selection and identified dysregulation of coenzyme A (CoA) metabolism as a facile driver of resistance to HAT inhibitors. Specifically, drug resistance selected for mutations in PANK3 , a pantothenate kinase that controls the rate limiting step in CoA biosynthesis 6 . These mutations prevent negative feedback inhibition, resulting in drastically elevated concentrations of intracellular acetyl-CoA, which directly outcompetes drug-target engagement. This not only impacts the activity of structurally diverse CBP/p300 HAT inhibitors, but also agents related to an investigational KAT6A/B inhibitor that is currently in Phase-1 clinical trials. We further validated these results using a genome-scale CRISPR/Cas9 loss-of-function genetic modifier screen, which identified additional gene-drug interactions between HAT inhibitors and the CoA biosynthetic pathway. Top hits from the screen included the phosphatase, PANK4 , which negatively regulates CoA production and therefore suppresses sensitivity to HAT inhibition upon knockout 7 , as well as the pantothenate transporter, SLC5A6 8 , which enhances sensitivity. Altogether, this work uncovers CoA plasticity as an unexpected but potentially class-wide liability of anti-cancer HAT inhibitors and will therefore buoy future efforts to optimize the efficacy of this new form of targeted therapy.

Abstract Many bacterial species are represented by a pan-genome, whose genetic repertoire far outstrips that of any single bacterial genome. Here we investigate how a bacterial pan-genome might influence gene essentiality, and whether essential genes that are initially critical for the survival of an organism can evolve to become non-essential. By using Tn-Seq, whole-genome sequencing, and RNA-Seq on a set of 36 clinical Streptococcus pneumoniae strains representative of >68% of the species’ pan-genome, we identify a species-wide ‘essentialome’ that can be subdivided into universal, strain-specific and accessory essential genes. By employing ‘forced-evolution experiments’ we show that specific genetic changes allow bacteria to bypass essentiality. Moreover, by untangling several genetic mechanisms we show that gene-essentiality can be highly influenced and/or dependent on: 1) the composition of the accessory genome; 2) the accumulation of toxic intermediates; 3) functional redundancy; 4) efficient recycling of critical metabolites; and 5) pathway rewiring. While this functional characterization underscores the evolvability-potential of many essential genes, we also show that genes with differential essentiality remain important antimicrobial drug target candidates, as their inactivation almost always has a severe fitness cost in vivo .

Antibiotics that inhibit peptidoglycan synthesis trigger the activation of both specific and general protective responses. σ M responds to diverse antibiotics that inhibit cell wall synthesis. Here, we demonstrate that cell wall inhibiting drugs, such as bacitracin and cefuroxime, induce the σ M -dependent ytpAB operon. YtpA is a predicted hydrolase previously proposed to generate the putative lysophospholipid antibiotic bacilysocin (lysophosphatidylglycerol), and YtpB is the branchpoint enzyme for the synthesis of membrane-localized C 35 terpenoids. Using targeted lipidomics we reveal that YtpA is not required for the production of lysophosphatidylglycerol. Nevertheless, ytpA was critical for growth in a mutant strain defective for homeoviscous adaptation due to a lack of genes for the synthesis of branched chain fatty acids and the Des phospholipid desaturase. Consistently, overexpression of ytpA increased membrane fluidity as monitored by fluorescence anisotropy. The ytpA gene contributes to bacitracin resistance in mutants additionally lacking the bceAB or bcrC genes, which directly mediate bacitracin resistance. These epistatic interactions support a model in which σ M -dependent induction of the ytpAB operon helps cells tolerate bacitracin stress, either by facilitating the flipping of the undecaprenyl-phosphate carrier lipid or by impacting the assembly or function of membrane-associated complexes proteins involved in cell wall homeostasis.

Bacterial vaginosis (BV), a common syndrome characterized by Lactobacillus -deficient vaginal microbiota, is associated with adverse health outcomes. BV often recurs after standard antibiotic therapy in part because antibiotics promote microbiota dominance by Lactobacillus iners instead of Lactobacillus crispatus , which has more beneficial health associations. Strategies to promote L. crispatus and inhibit L. iners are thus needed. We show that oleic acid (OA) and similar long-chain fatty acids simultaneously inhibit L. iners and enhance L. crispatus growth. These phenotypes require OA-inducible genes conserved in L. crispatus and related species, including an oleate hydratase ( ohyA ) and putative fatty acid efflux pump ( farE ). FarE mediates OA resistance, while OhyA is robustly active in the human vaginal microbiota and sequesters OA in a derivative form that only ohyA -harboring organisms can exploit. Finally, OA promotes L. crispatus dominance more effectively than antibiotics in an in vitro model of BV, suggesting a novel approach for treatment.

ABSTRACT Membrane lipid homeostasis is required for bacteria to survive in a spectrum of host environments. This homeostasis is achieved by regulation of fatty acid chain length and of the ratio of saturated to unsaturated fatty acids. In the pathogen Streptococcus pneumoniae , fatty acid biosynthesis is encoded by a cluster of fatty acid biosynthesis ( fab ) genes (FASII locus) whose expression is controlled by the FabT repressor. Encoded immediately downstream of the FASII locus is BriC, a competence-induced, cell-cell communication peptide that promotes biofilm development as well as nasopharyngeal colonization in a murine model of pneumococcal carriage. Here, we demonstrate that briC is co-transcribed with genes of the fab gene cluster and that a reduction of briC levels, caused by decoupling its transcription from fab gene cluster, negatively impacts biofilm development. BriC elevates fabT transcription, which is predicted to alter the balance of saturated and unsaturated fatty acids produced by the pathway. We find that briC inactivation results in a decreased production of unsaturated fatty acids that impact the membrane properties by decreasing the abundance of di-unsaturated phosphatidylglycerol molecular species. We propose that the link between BriC, FabT and phospholipid composition contributes to the ability of S. pneumoniae to alter membrane homeostasis in response to the production of a quorum-sensing peptide. IMPORTANCE Adaptation of bacteria to their host environment is a key component of colonization and pathogenesis. As an essential component of bacterial membranes, fatty acid composition contributes to host adaptation. Similarly, so does cell-cell communication, which serves as a mechanism for population levels responses. While much is known about the pathways that control the biosynthesis of fatty acids, many questions remain regarding regulation of these pathways and consequently the factors that impacts the balance between saturated and unsaturated fatty acids. We find that BriC, a cell-cell communication peptide implicated in biofilm regulation and colonization, is both influenced by a fatty acid biosynthesis pathway and impacts this same pathway. This study identified a link between cell-cell communication, fatty acid composition, and biofilms and, in doing so, suggests that these pathways are integrated into the networks that control pneumococcal colonization and host adaptation.

Abstract Fatty acid (FA) transfer proteins extract FA from membranes and sequester their ligand to facilitate its movement through the cytosol. While detailed views of soluble protein-FA complexes are available, how FA exchange occurs at the membrane has remained unknown. Staphylococcus aureus FakB1 is a prototypical bacterial FA transfer protein that binds palmitate within a narrow, buried tunnel. Here, we determine the conformational change from this closed state to an open state that engages the phospholipid bilayer. Upon membrane binding, a dynamic loop in FakB1 that covers the FA binding site disengages and folds into an amphipathic helix. This helix inserts below the phosphate plane of the bilayer to create a diffusion channel for the FA to exchange between the protein and the membrane. The structure of the bilayer-associated conformation of FakB1 has local similarities with mammalian FA binding proteins and provides a general conceptual framework for how these proteins interact with the membrane to promote lipid transfer.

ABSTRACT Detailed knowledge on how bacteria evade antibiotics and eventually develop resistance could open avenues for novel therapeutics and diagnostics. It is thereby key to develop a comprehensive genome-wide understanding of how bacteria process antibiotic stress, and how modulation of the involved processes affects their ability to overcome said stress. Here we undertake a comprehensive genetic analysis of how the major human pathogen Streptococcus pneumoniae responds to 20 antibiotics. We built a genome-wide atlas of drug susceptibility determinants and generate a genetic interaction network that connects cellular processes and genes of unknown function, which we show can be used as therapeutic targets. Pathway analysis reveals a genome-wide “tolerome”, defined by cellular processes that can make a bacterium less susceptible, and often tolerant, in an antibiotic specific manner. Importantly, modulation of these processes confers fitness benefits during active infections under antibiotic selection. Moreover, screening of sequenced clinical isolates demonstrates that mutations in tolerome genes readily evolve and are frequently associated with resistant strains, indicating such mutations may be an important harbinger for the emergence of antibiotic resistance.

Oleate hydratase (OhyA) is a bacterial peripheral membrane protein that catalyzes FAD-dependent water addition to membrane bilayer-embedded unsaturated fatty acids. The opportunistic pathogen Staphylococcus aureus uses OhyA to counteract the innate immune system and support colonization. Many Gram-positive and Gram-negative bacteria in the microbiome also encode OhyA. OhyA is a dimeric flavoenzyme whose carboxy terminus is identified as the membrane binding domain; however, understanding how OhyA binds to cellular membranes is not complete until the membrane-bound structure has been elucidated. All available OhyA structures depict the solution state of the protein outside its functional environment. Here, we employ liposomes to solve the cryo-electron microscopy structure of the functional unit: the OhyA•membrane complex. The protein maintains its structure upon membrane binding and slightly alters the curvature of the liposome surface. OhyA preferentially associates with 20-30 nm liposomes with multiple copies of OhyA dimers assembling on the liposome surface resulting in the formation of higher-order oligomers. Dimer assembly is cooperative and extends along a formed ridge of the liposome. We also solved an OhyA dimer of dimers structure that recapitulates the intermolecular interactions that stabilize the dimer assembly on the membrane bilayer as well as the crystal contacts in the lattice of the OhyA crystal structure. Our work enables visualization of the molecular trajectory of membrane binding for this important interfacial enzyme.

Bacterial vaginosis (BV), a common syndrome characterized by Lactobacillus-deficient vaginal microbiota, is associated with adverse health outcomes. BV often recurs after standard antibiotic therapy in part because antibiotics promote microbiota dominance by Lactobacillus iners instead of Lactobacillus crispatus, which has more beneficial health associations. Strategies to promote L. crispatus and inhibit L. iners are thus needed. We show that oleic acid (OA) and similar long-chain fatty acids simultaneously inhibit L. iners and enhance L. crispatus growth. These phenotypes require OA-inducible genes conserved in L. crispatus and related lactobacilli, including an oleate hydratase (ohyA) and putative fatty acid efflux pump (farE). FarE mediates OA resistance, while OhyA is robustly active in the vaginal microbiota and enhances bacterial fitness by biochemically sequestering OA in a derivative form only ohyA-harboring organisms can exploit. OA promotes L. crispatus dominance more effectively than antibiotics in an in vitro BV model, suggesting a metabolite-based treatment approach.